一、逆转录酶的发现、蛋白结构与核心性质

1. 发现：挑战中心法则的革命

20世纪70年代，Howard Temin和David Baltimore分别独立在RNA病毒中发现了一种能将以RNA为模板合成DNA的酶，即RNA依赖性DNA聚合酶，后被称为逆转录酶。这一发现颠覆了当时“遗传信息只能从DNA流向RNA”的中心法则，二人因此荣获1975年诺贝尔生理学或医学奖【1】。

2. 蛋白结构基础

逆转录酶包含多个关键功能域，主要由聚合酶域和RNase H域组成。其中聚合酶域的结构酷似一只右手，可进一步细分为三个亚域：

   “手指”亚域：主要负责与模板RNA的结合。

   “手掌”亚域：含有催化活性位点，负责聚合反应的核心化学过程。

   “拇指”亚域：参与结构的支持和产物的易位。

图一.逆转录酶蛋白结构及其活性^[2] 

3. 来源与演进

目前分子生物学中常用的逆转录酶主要来源于两种逆转录病毒：

   禽成髓细胞瘤病毒（AMV）：最早使用的酶之一，为异二聚体，最适反应温度42-48℃，但RNase H活性较强，易降解RNA模板，合成的cDNA较短（<5 kb）。

   莫洛尼鼠白血病病毒（M-MLV）：现为更主流的改造起点。其为单亚基酶（约75 kDa），最适温度37℃，野生型RNase H活性较低，更适合合成长片段cDNA（<7 kb），且易于进行基因工程改造。

4. 关键酶学性质与改造方向

野生型逆转录酶在应用中存在诸多局限，因此其核心性质的优化成为技术突破的关键：

   RNase H活性：在合成cDNA的同时会降解RNA模板，不利于长片段合成。改造方向是点突变失活RNase H结构域。

   热稳定性：高温可打开RNA二级结构（如高GC含量模板），但野生酶易失活。改造目标是提高至55-65℃仍具有活性。

   持续合成能力：酶从模板上解离前掺入的核苷酸数量。提高此能力可更高效合成全长cDNA（可达10-20 kb），并增强对样本中抑制剂的耐受性。

   保真度与末端转移酶（TdT）活性：前者影响序列准确性（对NGS重要）；后者在特定技术（如模板切换、RACE）中至关重要，需要精准调控。

二、翌圣生物的定向进化改造与新一代逆转录酶

1. 翌圣生物与ZymeEditor™平台

翌圣团队子公司镁孚泰生物依托ZymeEditor™创新型酶改造平台，将理性设计与定向进化有机结合，实现对酶性能的精准提升。针对M-MLV逆转录酶在高温下稳定性差、易失活，进而影响预混液储存及应用的问题，翌圣团队展开系统攻关。

2. ZymeEditor™平台改造策略

团队采用多维度、多层次的干湿实验交互筛选流程：

   理性/半理性设计：基于序列一致性分析、B-factor分析、吉布斯自由能变化分析以及二硫键设计等手段，精确识别结构中影响稳定性的“热点”氨基酸，设计能够稳固蛋白结构的定点突变，初步输出优势突变体。

   高通量筛选（MTPS）：利用高通量平台，对数千个突变体的稳定性、RNA/DNA催化偏好性、聚合酶活力进行多维度快速筛选。

   性能验证：对筛选出的优势突变体进行精细纯化与全面酶学表征。

图2. 理性与半理性设计改造M-MLV稳定性：(A) 理性与半理性设计及筛选过程；(B) 突变位点设计；(C)加速稳定性表征数据

3. 代表性进化成果：Hifair UCF.ME® Advanced逆转录酶

通过上述平台，翌圣成功推出了性能全面革新的Hifair UCF.ME® Advanced逆转录酶（Cat14614）。

   超高灵敏度：可在低至1 pg的总RNA模板下，搭配2分钟快速逆转录程序，仍能高效扩增特异性靶标。

   革命性的全预混稳定性：解决行业痛点。将逆转录酶与引物探针等全预混后，在37℃破坏性放置5天，其扩增曲线、Ct值及荧光值相比-20℃保存无任何变化，为液体试剂盒的储运和长期稳定性提供了根本保障。

   卓越的冻干适应性：其无甘油形式配制的全预混体系在冻干后，性能依然稳定，完美适配常温和冻干试剂的开发需求。

   超洁净品质（UCF.ME®）：由UCF.ME®超洁净分子酶生产基地生产，全封闭系统与严格质控确保三批次产品E. coli基因组DNA残留均＜0.02 copies/100 U，极大降低检测背景干扰，提高结果可靠性。

   广泛的NGS建库兼容性：在不同RNA模板投入量下，均能获得产量高、大小一致的文库，能出色地适用于高通量测序建库场景。

4. 全能型选手：Hifair® Ultra逆转录酶（Cat14604ES）

翌圣还拥有覆盖多场景的产品矩阵，其中Hifair® Ultra逆转录酶堪称“全能型”代表：

   超长片段：无RNase H活性，持续合成能力强，最大合成长度可达20 kb。

   高热稳定性：最高反应温度达65℃，完美兼容复杂结构RNA模板。

   TdT活性：具备末端转移酶活性，可应用于模板切换技术（如RACE、单细胞测序）。

   应用广泛：一个酶即可满足RT-qPCR、RNA-seq、cDNA克隆、单细胞测序等多种场景需求。

三、产品矩阵与公司定位

翌圣生物不仅提供单一产品，更构建了完善的逆转录酶产品与解决方案体系，服务于从基础科研到诊断、治疗的广阔市场：

1. 多元化产品选择：针对不同应用（如RT-LAMP、RNA-seq、RT-qPCR、单细胞测序）提供专用酶，并可提供无甘油、高低浓度等多种定制形式。
2. 强大的产业化能力：拥有从5L到1,500L的逐级放大发酵纯化系统，及5000余平米GMP标准生产基地，确保从研发到商业化阶段的稳定供应。
3. 战略定位：致力于成为生命科学工具产业领导者，依托ZymeEditor™平台和UCF.ME®生产基地两大基石，持续为全球客户提供高性能、高洁净度的分子酶原料，推动诊断与医药领域的创新发展。

四、相关产品推荐

产品类型	货号	产品名称	特点
逆转录酶（含甘油）	14614ES	Hifair UCF. ME® Advanced Reverse Transcriptase (200 U/μL)	1、低宿主残留，更适用于微生物检测场景； 2、适用于配置全预混RT-qPCR体系； 3、适用于RNA建库。
	14604ES	Hifair® Ultra Reverse Transcriptase（200 U/μL）	1、适用于全长转录组扩增； 2、适用于单细胞测序。
	11300ES	Hifair® V Reverse Transcriptase	适用于RT-PCR/RT-qPCR
	11112ES	Hifair® IV Reverse Transcriptase	适用于NGS建库
	11111ES	Hifair® III Reverse Transcriptase	适用于RT-LAMP
逆转录酶（无甘油）	14617ES	Hifair UCF. ME® Advanced Reverse Transcriptase, Glycerol-free (200 U/μL)	14614ES对应的无甘油版本
	11301ES	Hifair® V Reverse Transcriptase (600 U/μL, Glycerol-free)	11300ES对应的无甘油版本
	11297ES	Hifair® III Reverse Transcriptase, 600 U/μL, Glycerol-free	11111ES对应的无甘油版本

文献

1. Baltimore, D. (1970). RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature, 226(5252), 1209–1211.
2. eorgiadis, M. M., Jessen, S. M., Ogata, C. M., Telesnitsky, A., Goff, S. P., & Hendrickson, W. A. (1995). Mechanistic implications from the structure of a catalytic fragment of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase. Structure, 3(9), 879–892.