产品简介

 

Hieff NGS^® OnePot Flash DNA Library Prep Kit 是快速版酶切法建库试剂盒，本品采用高质量的片段化酶，将片段化模块与末端修复/加A模块合二为一，简化了操作流程，极大的降低了建库的时间和成本。适用于100 pg-500 ng常规动植物基因组、微生物基因组等样本，在单管内快速实现DNA的片段化、末端修复和A尾添加反应。本试剂盒需自行搭配接头和引物，可同时兼容Illumina^®和MGI^®高通量测序平台。

 

1.适用100 pg-500 ng的基因组DNA样本

2.兼容Illumina^®和MGI^®高通量测序平台

3.5 min完成片段化、末修反应

4.高效的文库转化率与扩增效率

 

组分信息

 

组分编号		组分名称	12316ES24	12316ES96
12316-A		Smearase® Mix	240 μL	960 μL
12316-B		Ligation Enhancer	720 μL	4×720 μL
12316-C		Fast T4 DNA Ligase	120 μL	480 μL
12316-D		2×Ultima HF Amplification Mix	600 μL	4×600 μL
*		Primer Mix*	120 μL	480 μL

注：*标注表示该成分不包含在本试剂盒，需要额外配置，本试剂盒组分兼容Illumina^®和MGI^®双平台，但需要额外配置专属于Illumina^®或者MGI^®的Primer Mix(Cat#12190 Primer Mix for Illumina^®以及Cat#12191 Primer Mix for MGI^®)

 

储存条件

 

-25~-15℃保存，有效期1年。

 

注意事项

 

• 关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒酶组分置于冰盒解冻，buffer组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒充分混匀，短离后置于冰上待用。

3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

4. 为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。

5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度。

6. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；使用专用的移液器等设备；并定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。

7. 本产品仅作科研用途！

二、关于DNA片段化

1. 本试剂盒兼容范围为100 pg–500 ng Input DNA。应尽可能使用A260/A280 = 1.8-2.0的高质量Input DNA。

2. 若Input DNA中引入高浓度金属离子螯合剂或其他盐，可能会影响后续实验，建议将DNA稀释在ddH₂O或TE Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.5; 0.1 mM EDTA)中进行片段化。

3. 对于常规的高质量基因组DNA，酶切时间参考表1。本试剂盒片段化偏好低，耐受各种GC含量的模板。

表1  常规基因组DNA片段化时间推荐表

插入片段主峰大小	片段化时间	优化范围
200 bp	5 min	3-8 min
150 bp	8 min	5-10 min

【注】：以上为推荐时间，需客户在自己的实验体系中进行微调，以达到最佳效果。

4. 参照片段化步骤推荐条件可将DNA酶切为所需大小，为保证优质稳定的片段化效果，片段化过程请于冰上操作。
5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

三、关于接头连接

1. Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。Adapter用量过高可能会产生较多Adapter Dimer；用量较低可能会影响连接效率及文库产量。表2、表3列举了使用本试剂盒，不同Input DNA量推荐的Adapter使用量。

表2  100 pg-500 ng Input DNA针对Illumina^®测序平台推荐的Adapter使用浓度

Input DNA	15 μM Adapter稀释倍数	稀释后投入量
50 ng-500 ng	10	5 μL
1 ng-50 ng	20	5 μL
100 pg-1 ng	30	5 μL

表3  100 pg-500 ng Input DNA针对MGI^®测序平台推荐的Adapter使用浓度

Input DNA	10 μM Adapter稀释倍数	稀释后投入量
50 ng-500 ng	不稀释	5 μL
10 ng-50 ng	10	5 μL
100 pg-10 ng	5	5 μL

四、关于文库扩增（Library Amplification）

文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表4列举了使用本试剂盒，获得1 mg文库的推荐循环数。

表4  100 pg-500 ng Input DNA推荐的循环数

Input DNA (ng)	Number of cycles required to generate 1 μg
500 ng	2-4
250 ng	4-6
100 ng	5-7
50 ng	7-9
5 ng	11-13
100 pg	14-16

五、DNA磁珠纯化与分选（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure^® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

2. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

4. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。

5. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

7. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4°C可保存2天，-20°C可保存1个月。

六、关于文库质检（Library Quality Analysis）

1. 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR绝对定量的方法。

3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit^®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

4. 文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop^®等。

5. 文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

 

使用说明

 

一、自备材料

1. 纯化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效产品。

2. DNA质控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效产品。

3. DNA Adapter：针对Illumina平台，Yeasen提供96种Barcoded Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 2 (Cat#13519~Cat#13520)；双端384种 Index Primers: Hieff NGS^® Stubby UDI Primer Kit for Illumina^®（板式） , Set 1~Set 4  (Cat#12327~Cat#12330)。针对MGI平台，Yeasen提供96种Barcoded Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for MGI^®， Set 1~Set 3(Cat#13360~Cat#13362)；双端384种 Index Primers: Hieff NGS^® Unique Dual Barcode Adapter Kit for MGI^®（板式） , Set 1~Set 4  (Cat#13350~Cat#13353)其他等效产品。
4. 其他材料：无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.5; 0.1 mM EDTA)、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。

二、操作流程

图1 OnePot Flash DNA建库试剂盒快速建库流程

 

 

Ver. CN20240319