本产品是大肠杆菌重组表达来源的噬菌体T7 RNA聚合酶，以含有T7启动子序列（5’-TAATACGACT CACTATAG*-3’）的双链DNA为模板，以NTP为底物，合成与启动子下游的反向单链DNA互补的RNA。双链线性平末端或5’突出末端DNA均可作为T7 RNA聚合酶的底物模板，因此线性质粒、PCR产物均可用作体外合成RNA的模板。

注：G*为RNA转录的第一个碱基。

 

产品性质

来源（Source）	重组E. coli
最适温度（Optimum Temperature）	37℃
宿主核酸残留（Host Nucleic acid Residue）	<10 fg/U
宿主蛋白残留（Host Protein Residue）	<50 ppm
RNA酶残留（RNase Residue）	阴性
储存缓冲液（Storage Buffer）	50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 100 mM NaCl, 0.1% Triton X-100，50%（v/v）甘油，pH7.9@25℃
活性单位定义（Unit Definition）	在 37℃、pH8.0 的条件下，1 h内使 1 nmol 的 [3H] GMP 掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量定义为1个活性单位。

【注】：具体产品质检数据及更多指标请查看批次质检报告。

 

产品组分

组分编号	组分名称	产品编号/规格
		10626ES10 (10 KU)	10626ES60 (100 KU)
10626-A	T7 RNA polymerase (250 U/μL)	40 μL	400 μL
10626-B	10×Transcription Buffer	500 μL	1 mL×5

【注】：10×Transcription Buffer中含460 mM MgCl2和100 mM DTT，但不含有NTP，如需请购买本翌圣产品Cat#10133。

 

产品应用

1. 单链 RNA合成（包括mRNA，siRNA，gRNA等各类RNA前体，以及同位素标记或非同位素标记的RNA探针）。

2. 以（Cap analog）为引物合成Capped mRNA。

 

运输和保存方法

干冰运输。-20℃保存，有效期一年。

 

注意事项

1. DNA模板的种类：推荐使用含T7启动子的线性化质粒和PCR产物作为模板。

2. 转录模板的纯度会显著影响体外转录反应。在质粒DNA抽提过程中残留的RNase A会显著影响转录RNA的质量。通过酚-氯仿抽提的质粒DNA为最佳模板；PCR产物建议采用胶回收纯化后使用。

3. 在20 μL反应体系中加入0.02 U热稳定无机焦磷酸酶可显著提高转录产量。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

应用实例

按下列体系配制反应体系

组分	体积（μL）	终浓度
10×Transcription Buffer (Mg2+ Plus)	2	1×
CTP/GTP/ATP/UTP (100 mM each)	0.4 each	2 mM each
T7 RNA Polymerase (250 U/μL)	0.8	-
RNase inhibitor (40 U/μL)	1	-
RNase free H2O	Up to 18	-
模板DNA	2 (100 ng-1μg)	-

注： 1) DNA模板需要最后加入。由于10×Buffer中含有亚精胺，亚精胺浓度过高会引起DNA模板沉淀。
2) Buffer和水建议放置到室温，然后开始使用，反应于室温下配制，防止温度低引起亚精胺沉淀高浓度DNA模板。
3) 若转录长度< 100 nt，模板投入量可增加至2 μg。
4) RNase inhibitor (40 U/μL)请购买翌圣产品Cat#10603。
5) 为了特定区域的有效转录，建议在其区域下游把模板DNA预先切成平端或5′突出末端。

2. 在37℃下反应1-2 h（若转录长度≤ 100 nt，增加时间至4-8 h）。

3. 反应结束后，使用2 U DNaseⅠ（无RNase）37℃、15 min去除DNA模板。

4. 转录产物纯化：体外转录产物可选用RNA Cleaner磁珠进行纯化（翌圣产品Cat#12602），以去除蛋白、盐离子和其他杂质。也可以采用酚/氯仿纯化法（具体操作步骤可联系翌圣索取）。

 

HB220325