DNase I 作为核酸实验中经典的 DNA 降解工具酶，广泛应用于 RNA 样本纯化、体外转录、RNA-seq 建库等多个分子生物学实验场景，其酶活特性、使用方法及场景适配性直接影响实验结果。本文针对客户使用过程中的高频问题逐一解答，为实验操作提供权威、可落地的参考。

一、基础特性类

1. 翌圣生物 DNase I 有哪些类型，核心区别是什么？

翌圣生物提供四大类 DNase I 产品，均经过严格的酶活与纯度验证，适配不同实验场景的需求，核心区别基于来源、纯度等级与应用定位，具体如下：

Description	Catalog No.	Application
提取自牛胰腺，经色谱工艺制备，核糖核酸酶A（RNase A）活性含量极低。为冻干粉剂。	10607ES	1、从样本中提取RNA时去除gDNA。（如果是微量样本，需要用重组来源的DNase I）。 2、蛋白质研究: 从蛋白制备物中去除DNA。
提取自牛胰腺，经色谱工艺制备，核糖核酸酶A（RNase A）活性含量极低（≤0.0005%）。为冻干粉剂。	10608ES
大肠杆菌重组表达DNase I (RNase-free)，大肠杆菌重组表达，不含RNase，液体形式。	10325ES	适用于各种应用：RNA提取过程中的基因组DNA去除、反转录前的基因组DNA清除、体外转录后模板DNA的消化、RNA建库过程中rRNA去除、缺口平移法进行DNA标记、DNase I足迹法分析实验、需要避免动物源成分的应用场景等。
毕赤酵母重组表达DNase I (RNase-free)，不含RNase，液体形式。	14549ES
	14550ES
大肠杆菌重组表达DNase I (RNase-free)，GMP-grade，液体形式。	10611ES	GMP药用级别。用于采用药用规格原辅料生产，符合GMP规范的产品生产与质量管理规程保障生产过程及所有原辅料可追溯。

   

2. 翌圣 RNase-free DNase I 的酶活特性是什么，为何能适配各类 RNA 相关实验？

翌圣 RNase-free DNase I 为非特异性核酸内切酶，可通过水解 DNA 的磷酸二酯键，高效降解单链、双链 DNA 及染色质 DNA，且对 RNA 无任何降解活性。同时酶活依赖 Mg²⁺，可通过 EDTA 螯合二价离子高温加热快速彻底灭活，无残留酶活干扰下游实验，这一特性完美匹配 RNA 样本处理的核心要求 ——仅除 DNA，不损 RNA，是各类 RNA 相关实验的核心酶。

若下游实验对EDTA敏感，可选择使用翌圣生物热敏dsDNase （Cat#14533ES or 14544ES），dsDNase能够特异性的消化双链DNA而不会消化单链DNA、引物、探针和RNA。dsDNase具有热敏感性，可在65℃条件下快速失活，可在不引入EDTA的条件下快速灭活，降低对下游实验体系的干扰。

  

二、实验操作类

1. 使用 DNase I 处理 RNA 样本时，最关键的操作要点是什么？

核心遵循冰上操作、先螯合后加热、全程无 RNase三大原则：

• 所有试剂、耗材需保证 RNase-free，RNA 样本全程冰上解冻与处理，避免高温导致 RNA 降解；
• DNase I 反应体系需加入配套的 10× 反应缓冲液，为酶活提供最优的离子环境与 pH；
• 酶活终止必须先加 EDTA，后加热：EDTA 先螯合 Mg²⁺（DNase I 必需离子，同时防止高温下 Mg²⁺诱导 RNA 自发降解），再经 65~75℃加热 5~15 min 彻底灭活酶，不可颠倒顺序；
• 反应完成后短暂离心收集液体，冰上冷却后再进行下游实验。

2. DNase I 处理后的 RNA 样本，是否需要额外纯化？能否直接用于下游实验？

无需额外纯化，可直接用于下游实验，DNase I 处理后体系中 EDTA 终浓度约 2.5 mM，该浓度既能有效终止酶活、保护 RNA，又不会抑制逆转录酶、Taq 酶、建库酶等下游酶活（此类酶可通过自身反应体系中的 Mg²⁺抵消 EDTA 的轻微影响）；若样本含少量杂质，仅需简单的磁珠 / 柱式纯化即可，无需复杂的酚氯仿抽提，避免 RNA 损失。

三、问题排查类

1. DNase I 处理后，RT-PCR/qRT-PCR 仍出现 DNA 扩增条带，可能是什么原因？

核心为DNA 未完全降解，需从以下 4 点排查，均为文献验证的常见问题：

• 酶量不足：未按「1~2 μg RNA 加 1 U DNase I」的比例添加，或重度 DNA 污染样本未稀释放大体系；
• 反应时间不足：37℃孵育时间＜30 min，DNase I 未充分发挥酶活；
• 反应缓冲液未添加 / 添加量不足：DNase I 需配套 10× 缓冲液提供 Mg²⁺，无缓冲液会导致酶活大幅降低；
• 样本中存在 DNase I 抑制剂：如样本含酚、胍、EDTA 等，需先对样本进行纯化，再进行 DNase I 处理。

2. DNase I 处理后，RNA 样本出现降解，该如何排查？

RNA 降解为RNase 污染或操作不当导致，三大文献均明确了排查方向：

• 耗材 / 试剂非 RNase-free：如离心管、吸头未做无酶处理，或 RNase-free H₂O 被污染，需更换无酶耗材与试剂；
• 灭活顺序颠倒：先加热后加 EDTA，高温下 Mg²⁺诱导 RNA 自发降解，需严格遵循「先加 EDTA，后加热」的顺序；
• 操作环境有 RNase：如实验台、移液器被 RNase 污染，需用 RNase 清除剂擦拭，全程戴无粉手套操作。

3. DNase I 处理后的样本，下游反转录 / 建库效率低，可能的原因是什么？

排除 RNA 降解后，主要为酶活未彻底灭活或体系配比不当，排查与解决方法如下：

• 灭活不彻底：65~75℃加热时间＜5 min，DNase I 残留酶活会降解下游反转录 / 建库的 cDNA/DNA 产物，需将加热时间延长至 10~15 min；
• EDTA 添加过量：若自行增加 EDTA 用量，会导致下游酶活被严重抑制，需按标准比例添加（终浓度约 2.5 mM），或在下游体系中适当补充 Mg²⁺；
• DNase I 反应体系体积过大：未按比例稀释，导致 RNA 样本浓度过低，下游实验模板不足，需按标准体系配制，避免过度稀释。

四、产品使用与保存类

1. 翌圣 DNase I 系列产品的保存条件是什么，如何保证酶活稳定性？

翌圣 DNase I 全系列产品均为液体即用型，保存条件为-25~-15℃避光保存，避免反复冻融（反复冻融会导致酶活下降）；若需频繁使用，可将酶分装为 10 μL / 管的小份，-25~-15℃保存，单次使用一支，有效保证酶活稳定性；配套的 10× 反应缓冲液可与酶同条件保存。

2. 翌圣 DNase I 的有效期是多久，使用前是否需要复溶？

翌圣 DNase I 全系列产品有效期为 2 年（-25~-15℃保存），产品为液体即用型，无需复溶，从-25~-15℃取出后冰上解冻，轻轻混匀后即可使用，避免剧烈涡旋（剧烈涡旋会导致酶蛋白变性，降低酶活）。

翌圣生物分子酶产品线：除 DNase I 外，还提供反转录酶、Taq 酶、高保真酶、连接酶、核酸酶等全系列分子生物学工具酶，均经过严格的实验验证，适配各类核酸实验场景，为科研与工业实验提供稳定、可靠的试剂解决方案。

 

参考文献

1、Green M R, Sambrook J. Removing DNA contamination from RNA samples by treatment with RNase-free DNase I[J]. Cold Spring Harbor Protocols, 2019, 2019(10): pdb. prot101725.

2、Gebre M S, Rauch S, Roth N, et al. Optimization of non-coding regions for a non-modified mRNA COVID-19 vaccine[J]. Nature, 2022, 601(7893): 410-414.

3、Huang Y, Sheth R U, Kaufman A, et al. Scalable and cost-effective ribonuclease-based rRNA depletion for transcriptomics[J]. Nucleic acids research, 2020, 48(4): e20-e20.