在生物体内，rRNA丰度高且非常保守，其对于获取生物信息研究意义不大。然而，实验过程中提取到的总RNA中有95%是人源rRNA，这些rRNA的存在可能会干扰靶标RNA的检测。因此，在RNA建库测序中，通常会先将rRNA去除。目前，rRNA的去除方式以RNA酶消法为主，其主要操作步骤与原理如下：

 

图1. rRNA去除流程[2]

本文基于《Nucleic Acids Research》2020 年顶级文献 **（Scalable and cost-effective ribonuclease-based rRNA depletion for transcriptomics）中经典的 RNase H 介导 rRNA 去除体系，结合翌圣生物 RNase-free DNase I 产品特性，为科研用户提供一套可直接落地、高适配、低成本的 RNA 建库前 rRNA 去除操作指南，完美适配细菌转录组、微生物宏转录组等建库场景。

一、实验材料（翌圣产品匹配）

试剂	翌圣货号
RNasefree DNase I	14549ES or 10325ES
10× DNase I 反应缓冲液	14549ES or 10325ES
25 mM EDTA	60416ES
RNase H	12906ES
RNasefree H₂O	无酶水
经 RNase H 处理的 RNA 样本	客户制备

  

二、标准实验步骤

本流程基于文献中优化后的 RNase H-rRNA 去除体系，针对 500 ng 片段化 / 条形码标记 RNA 样本设计，可根据实际样本量按比例缩放，全程适配高通量 RNA-seq 建库前处理：

前期准备

1. 完成 RNase H 介导的 rRNA 降解：按文献方法，将 ssDNA 探针与 RNA 样本按 5:1 比例杂交，经 10 U RNase H（37℃，30 min）降解 rRNA，得到含残留 ssDNA 探针的 RNA 样本；

2. 所有试剂、耗材均需保证无 RNase/DNase，操作在超净工作台中进行，全程冰上操作。

标准操作步骤

1. 体系配制：取经 RNase H 处理的 RNA 样本，按以下比例配制 DNase I 消化体系（终体积 50 μL），充分混匀后短暂离心收集液体：

组分	体积
经 RNase H 处理的 RNA 样本	30 μL
10× DNase I 反应缓冲液	5 μL
RNasefree DNase I	3 U
RNasefree H₂O	To 50 μL

注：若处理 RNA 样本量＞500 ng，按1 U DNase I/100 ng RNA比例提升酶量，同时按比例放大 10× 反应缓冲液体积，RNase-free H₂O 补足体系，反应温度和时间保持不变。

2. 酶切反应：混匀后短暂离心，37℃孵育30 min，充分降解质粒DNA。

3. 终止与灭活：

①加入 5.5 μL 25 mM EDTA（终浓度～2.5 mM）；

② 65℃ 加热 10 min，彻底灭活 DNase I。

4. 样本后处理：

①加热完成后，将样本迅速置于冰上冷却 5 min；

②短暂离心收集管底液体，可直接进行RNA 纯化（磁珠 / 柱式纯化），纯化后即可用于反转录、RNA-seq 建库等下游实验。

三、文献关键细节解读（实验避坑要点）

1. 必须使用 RNase-free 级 DNase I，严禁普通 DNase I 替代

文献明确强调：经 RNase H 处理后的 mRNA 为裸露的单链 RNA，极易被 RNase 降解，普通 DNase I 含有的微量 RNase 会直接导致目标 RNA 降解，造成转录组建库无产物或数据失真。翌圣 10325ES 重组 DNase I 经多重色谱纯化，全程无 RNase 引入，经严格检测无 RNase 残留，完美匹配文献要求，彻底保护 mRNA 完整性。

2. DNase I 酶量需充足，避免探针残留

残留的 ssDNA 探针会在反转录阶段与 mRNA 竞争引物，或作为杂质被建库酶扩增，导致建库产物杂带多、测序数据中出现探针序列干扰。文献推荐按探针量的 1.2 倍添加 DNase I，实际操作中按本流程 3 U/500 ng RNA 添加，可覆盖绝大多数实验场景的探针降解需求。

3. 终止灭活顺序：先加 EDTA，后加热，不可颠倒

· EDTA 先螯合反应体系中的 Mg²⁺（DNase I 的必需离子），不仅能终止酶活，更能防止高温下 Mg²⁺诱导 RNA 自发降解；

· 后续 65℃加热仅为彻底灭活 DNase I，因无游离二价离子，不会对 RNA 造成损伤，这是文献中验证的最优灭活策略。

4. 适配片段化 / 条形码标记 RNA，兼容高通量建库

该流程专为 RNA-seq 建库设计，文献中已验证可适配RNAtag-seq等高通量条形码标记体系，DNase I 处理不会降解 RNA 上的条形码接头，也不会对片段化 RNA 的完整性造成影响，处理后样本建库成功率＞95%。

5. 处理后无需额外纯化，直接适配下游建库

本流程中 EDTA 终浓度约 2.5 mM，文献验证该浓度不会抑制反转录酶、Taq 酶等建库相关酶活，若样本纯度较高，经 DNase I 处理后可直接进行反转录；若样本含杂质，仅需简单磁珠纯化即可，简化实验步骤。

翌圣DNase I 选择指南

为满足不同的应用需求，翌圣可提供牛胰腺提取来源,E. coli重组表达、酵母重组表达来源的DNase I，并可提供GMP级别DNase I，以满足mRNA体外转录等应用。

Description	Catalog No.	Application
提取自牛胰腺，经色谱工艺制备，核糖核酸酶A（RNase A）活性含量极低。为冻干粉剂。	10607ES	1、从样本中提取RNA时去除gDNA。（如果是微量样本，需要用重组来源的DNase I）。 2、蛋白质研究: 从蛋白制备物中去除DNA。
提取自牛胰腺，经色谱工艺制备，核糖核酸酶A（RNase A）活性含量极低（≤0.0005%）。为冻干粉剂。	10608ES
大肠杆菌重组表达DNase I (RNase-free)，大肠杆菌重组表达，不含RNase，液体形式。	10325ES	适用于各种应用：RNA提取过程中的基因组DNA去除、反转录前的基因组DNA清除、体外转录后模板DNA的消化、RNA建库过程中rRNA去除、缺口平移法进行DNA标记、DNase I足迹法分析实验、需要避免动物源成分的应用场景等。
毕赤酵母重组表达DNase I (RNase-free)，不含RNase，液体形式。	14549ES
	14550ES
大肠杆菌重组表达DNase I (RNase-free)，GMP-grade，液体形式。	10611ES	GMP药用级别。用于采用药用规格原辅料生产，符合GMP规范的产品生产与质量管理规程保障生产过程及所有原辅料可追溯。

 

参考文献

1、Huang Y, Sheth R U, Kaufman A, et al. Scalable and cost-effective ribonuclease-based rRNA depletion for transcriptomics[J]. Nucleic acids research, 2020, 48(4): e20-e20.