本产品是大肠杆菌重组表达来源的噬菌体T7 RNA聚合酶，以含有T7启动子序列（5’-TAATACGACT CACTATAG*-3’）的双链DNA为模板，以NTP为底物，合成与启动子下游的反向单链DNA互补的RNA。双链线性平末端或5’突出末端DNA均可作为T7 RNA聚合酶的底物模板，因此线性质粒、PCR产物均可用作体外合成RNA的模板。

注：G*为RNA转录的第一个碱基。

 

产品组分

编号	组分	产品编号/规格
		10618ES90 (5000 U)	10618ES96 (25000 U)	10618ES97 (50000 U)
10618-A	T7 RNA polymerase (50 U/μL)	100 μL	500 μL	1 mL
10618-B	10×Transcription Buffer	400 μL	1 mL ×2	1 mL ×4

注：10×Transcription Buffer中含460 mM MgCl2和100 mM DTT，但不含有NTP，如需请购买本公司NTP set solution 10133。

 

产品应用

1. 单链 RNA合成（包括mRNA，siRNA，gRNA等各类RNA前体，以及同位素标记或非同位素标记的RNA探针）

2. 以（Cap analog）为引物合成Capped mRNA

 

酶活定义

在 37℃、pH8.0 的条件下，1h内使1 nmol 的 [3H] GMP 掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量定义为1个活性单位。

 

运输和保存方法

干冰运输。-20℃保存，有效期一年。

 

质量控制

核酸外切酶残留检测：100 U的本酶和0.5 μg λ DNA-Hind III酶切产物37℃下孵育4 h，DNA的电泳谱带不发生变化。

切口酶残留检测：100 U的本酶和0.5 μg IL23R质粒，37℃下孵育4 h，DNA的电泳谱带无变化。

RNase残留检测：100 U的本酶和0.5 μg  293T细胞总RNA，37℃下孵育4 h，RNA的电泳谱带无变化。

 

注意事项

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 本产品仅做科研用途！

 

应用实例

按下列体系配制反应体系

组分	体积（μL）	终浓度
10×Transcription Buffer (Mg2+ Plus)	2	1×
CTP / GTP/ ATP/ UTP (100 mM each)	0.4 each	2 mM each
T7 RNA Polymerase (50 U/μL)	0.5-1	-
RNase inhibitor (40 U/μL)	1	-
RNase free H2O	Up to 18	-
模板DNA	2 (100 ng-1μg)	-

注： 1. DNA模板需要最后加入。由于10×Buffer中含有亚精胺，亚精胺浓度过高会引起DNA模板沉淀。

2. Buffer和水建议放置到室温，然后开始使用，反应于室温下配制，防止温度低引起亚精胺沉淀高浓度DNA模板。

3.若转录长度< 100 nt，模板投入量可增加至2 μg。

4. RNase inhibitor (40 U/μL)请购买本公司产品10603。

5.为了特定区域的有效转录，建议在其区域下游把模板DNA预先切成平端或5′突出末端。

37℃反应1-2 h（若转录长度≤ 100 nt，增加时间至4-8 h）。

反应结束后，使用2 U DNaseⅠ（无RNase）37℃ 15分钟去除DNA模板。

转录产物纯化：体外转录产物可选用RNA Cleaner磁珠进行纯化（12602），以去除蛋白、盐离子和其他杂质。也可以采用酚/氯仿纯化法（具体操作步骤可联系Yeasen索取）。

 

操作建议

1.DNA模板的种类：推荐使用含T7启动子的线性化质粒和PCR产物作为模板。

2.转录模板的纯度会显著影响体外转录反应。在质粒DNA抽提过程中残留的RNase A会显著影响转录RNA的质量。通过酚-氯仿抽提的质粒DNA为最佳模板；PCR产物建议采用胶回收纯化后使用。

3.在20 μL反应体系中加入0.02 U热稳定无机焦磷酸酶可显著提高转录产量。

 HB220118