RNA作为实验室常研究的样本，其质量的高低会直接影响实验数据的质量。一般在RNA提取过程中无法完全避免gDNA残留，因此，在进行对RNA纯度要求较高的实验之前，通常建议对RNA样本进行DNase I处理，消化残留的gDNA。消化gDNA步骤可以在RNA提取期间、RNA提取后或者RNA反转录之前进行。

需提前去除gDNA的实验一般包括：mRNA表达量分析、转录组分析、mNGS检测等。

 

图1. 基于DNase I的gDNA去除流程

本文基于权威文献《Removing DNA Contamination from RNA Samples by Treatment with RNase-Free DNase I》进行专业解读，结合翌圣生物 RNasefree DNase I 产品特性，为科研用户提供一套可直接落地、标准化的 gDNA 去除操作方案。

一、实验材料（翌圣产品匹配）

试剂	翌圣货号
RNasefree DNase I	14549ES or 10325ES
10× DNase I 反应缓冲液	14549ES or 10325ES
25 mM EDTA	60416ES
RNasefree H₂O	无酶水
RNA 样本	客户提取总 RNA

  

二、标准实验步骤

1. 冰上解冻RNA 样本，避免高温引起 RNA 降解。

2. 按以下体系配制反应液（终体积 20 μL）：

组分	体积
10× DNase I 反应缓冲液	2 μL
RNasefree DNase I	1 U (每 1–2 μg RNA)
RNasefree H₂O	To 20 μL
RNA 样本	客户提取总 RNA

3. 混匀后短暂离心，37℃孵育 30 分钟，充分降解 gDNA。

4. 加入2.5 μL 25 mM EDTA，混匀。

5. 65–75℃加热 5–10 分钟，双重灭活 DNase I。

6. 短暂离心收集液体，冰上冷却，即可用于下游实验。

  

三、文献关键细节解读（实验避坑要点）

1. 样本量与酶用量原则

· 单反应体系推荐 RNA ≤10 μg，gDNA 污染水平≤10 μg/mL。

· 若 RNA＞10 μg 或污染严重（＞10 μg/mL），应稀释样本并按比例放大反应体系，保证酶量充足。

2. 灭活必须遵循：先加 EDTA，再加热

· EDTA 螯合二价金属离子，防止高温下 RNA 自发降解。

· 高温使 DNase I 彻底失活，避免干扰后续 PCR。

· 终浓度 EDTA 约 2.5 mM，不抑制逆转录酶等下游酶。

3. 其他去污染方法对比（文献补充）

· 酸性酚：氯仿抽提：DNA 进入有机相，RNA 保留在水相

· LiCl 沉淀：选择性沉淀 RNA，但重度 gDNA 污染时效果有限

结论：DNase I 酶解法通用性最强、操作最简单、稳定性最好

  

翌圣DNase I 选择指南

为满足不同的应用需求，翌圣可提供牛胰腺提取来源,E. coli重组表达、酵母重组表达来源的DNase I，并可提供GMP级别DNase I，以满足mRNA体外转录等应用。

Description	Catalog No.	Application
提取自牛胰腺，经色谱工艺制备，核糖核酸酶A（RNase A）活性含量极低。为冻干粉剂。	10607ES	1、从样本中提取RNA时去除gDNA。（如果是微量样本，需要用重组来源的DNase I）。 2、蛋白质研究: 从蛋白制备物中去除DNA。
提取自牛胰腺，经色谱工艺制备，核糖核酸酶A（RNase A）活性含量极低（≤0.0005%）。为冻干粉剂。	10608ES
大肠杆菌重组表达DNase I (RNase-free)，大肠杆菌重组表达，不含RNase，液体形式。	10325ES	适用于各种应用：RNA提取过程中的基因组DNA去除、反转录前的基因组DNA清除、体外转录后模板DNA的消化、RNA建库过程中rRNA去除、缺口平移法进行DNA标记、DNase I足迹法分析实验、需要避免动物源成分的应用场景等。
毕赤酵母重组表达DNase I (RNase-free)，不含RNase，液体形式。	14549ES
	14550ES
大肠杆菌重组表达DNase I (RNase-free)，GMP-grade，液体形式。	10611ES	GMP药用级别。用于采用药用规格原辅料生产，符合GMP规范的产品生产与质量管理规程保障生产过程及所有原辅料可追溯。

 

参考文献

1、Green M R, Sambrook J. Removing DNA contamination from RNA samples by treatment with RNase-free DNase I[J]. Cold Spring Harbor Protocols, 2019, 2019(10): pdb. prot101725.