血液是人体内信息最丰富的液体之一。当病原体入侵机体后，其细胞在凋亡或坏死过程中释放出的DNA片段会进入血液循环，形成微生物细胞游离DNA（microbial cell-free DNA, mcfDNA） 。这些短小的DNA片段如同病原体在血液中留下的“分子足迹”，记录着感染事件的真实信息。

以宏基因组下一代测序（metagenomic next-generation sequencing, mNGS）技术对这些血浆中微量的微生物cfDNA进行无偏倚测序，能够一次性检测上万种病原微生物，精准鉴定病原体。该技术不依赖活菌，受抗生素前置使用的显著干扰较小，且能捕捉到碎片化的病原DNA。采样无创、易获取，为不明原因发热、脓毒症等疑难危重感染患者的救治提供了重要的诊断依据，已成为感染性疾病诊断的重要工具。

一、血液中的"微生物碎片密码"

血浆中循环的游离DNA（cfDNA）并非新鲜概念，但人们长期聚焦于肿瘤来源或胎儿来源的人源cfDNA。直到近年，研究人员才系统证实：在感染状态下，病原体死亡裂解后会将其DNA片段释放至血液循环，形成微生物细胞游离DNA（microbial cell-free DNA, mcfDNA）。这些片段通常高度碎片化（平均约50-150 bp），丰度极低，在总cfDNA中占比往往不足1%，却携带着感染部位的"分子指纹"。

宏基因组下一代测序（mNGS）技术的核心优势在于无偏倚检测——无需培养、无需预设引物，通过高通量测序直接读取样本中所有DNA分子的序列信息，再与病原体数据库比对。这一技术本质上是对感染病灶的"液体活检"，避免了传统采样对病灶部位的侵入性操作。

mcfDNA在血浆中的动力学特征具有独特临床价值。研究表明，mcfDNA的阳性持续时间显著长于传统血培养：在金黄色葡萄球菌菌血症中，mcfDNA中位阳性时间为15天，而血培养仅3天；在革兰阴性菌感染中，mcfDNA中位阳性时间为8天，血培养甚至可为0天。这意味着，即使在经验性抗生素使用后，mcfDNA仍能在较长时间窗口内被检出，极大弥补了血培养在抗生素暴露后敏感性骤降的短板。

图1 宏基因组测序原理图（图片来源：网，侵删）

二、血浆cfDNA宏基因组测序的工作原理

2.1 从血液到报告的关键步骤

血浆cfDNA 宏基因组测序的完整流程可分为“湿实验”和“干实验”两大阶段。

第一步：血浆分离与核酸提取。采集全血后，通过低速离心分离出血浆。由于血液样本中99%以上的游离DNA来自宿主（人类基因组），且微生物cfDNA含量极低、高度片段化，提取效率是决定检测成败的首要因素。

第二步：文库构建。提取的cfDNA经末端修复、接头连接等步骤构建测序文库。由于起始模板量极低（通常仅数纳克），建库过程对试剂体系的灵敏度和稳定性要求较高。

第三步：高通量测序。将构建好的文库加载到测序仪上进行大规模并行测序。

第四步：生物信息学分析。这是cfDNA 宏基因组测序中最具技术挑战性的环节。原始测序数据需经过质控、去除人源序列、与病原体数据库比对、背景噪声过滤等步骤，最终识别出具有临床意义的病原体。算法模型需要通过多层过滤与统计建模体系，完成宿主序列去除、噪音数据库比对、病原特异性片段识别及结合临床流行病学概率进行评分。

2.2 为什么检测cfDNA而非全血DNA？

全血中含有大量完整的白细胞，这些白细胞破裂后会释放大量人源基因组DNA（gDNA），形成极厚的宿主背景，严重挤占测序资源和病原信号。研究表明，基于全血gDNA的mNGS若不经宿主去除处理，其微生物reads仅为925 RPM（reads per million） ，而经宿主细胞去除后微生物reads可提升至9351 RPM，超过未处理组的10倍。选择血浆cfDNA进行检测的优势在于，它直接利用血液中天然存在的游离核酸，白细胞已通过离心去除，人源核酸背景相对较低，检测更加直接高效。

三、关键挑战与应对策略

3.1 低丰度病原体漏检

血浆中微生物cfDNA含量极低且高度片段化，在低病毒载量样本中常出现漏检情况。解决思路包括：通过提高测序数据量增加低丰度信号的捕获概率；通过对目标病原体进行靶向富集后再测序；以及开发更灵敏的宿主去除方法以降低人源背景干扰。

3.2 环境背景污染与假阳性

这可能是血浆cfDNA 宏基因组测序面临的最棘手问题。一项跨130个实验室的大型评估研究显示，检测中的假阳性序列中有68.25% 来自于“湿实验”（即实验室的试剂、环境或耗材污染），而假阴性错误的主要来源（74.24% ）则是“干实验”分析环节。

2026年4月发布的《宏基因组高通量测序技术临床实验室规范化应用指南》专门强调了背景微生物的控制要求，明确指出主要来源为试剂、环境和耗材，实验室需建立覆盖全流程的背景微生物数据库。应对策略包括：每批次试剂均需进行背景微生物确认，建立配套的标准阳性参考品，以及构建并持续更新背景噪声数据库。

3.3 不同类型病原体的检测差异

2025年的一项跨实验室评估发现，病毒cfDNA的检测性能普遍弱于细菌和真菌。这一差异主要源于病毒基因组较小、血浆中拷贝数更低，以及部分DNA病毒在感染周期中释放的游离DNA量有限。对此的应对措施包括增加测序深度以捕获低丰度病毒信号，以及针对RNA病毒开发同时检测DNA和RNA的工作流程。

四、总结

血浆微生物cfDNA宏基因组测序技术的出现，为感染性疾病的诊断开辟了全新的路径——它不依赖培养，无需预设靶标，一次检测即可无偏倚覆盖细菌、真菌、病毒和寄生虫等各类病原体。通过直接从血液中捕捉病原体释放的“分子痕迹”，该技术在抗生素治疗后的诊断场景、混合感染的全面识别以及疑难危重感染的病因追溯中展现出传统方法无法比拟的优势。

然而，技术的推广仍面临严峻挑战：微生物cfDNA含量极低、背景污染控制困难、检测流程复杂且尚未完全标准化。2026版国家指南的发布为行业提供了统一的规范化框架，推动mNGS从探索阶段迈入标准化的临床实践。翌圣生物致力于为血浆cfDNA 宏基因组测序提供从核酸提取到文库构建的完整解决方案，助力感染性疾病精准诊断的持续发展。

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