干细胞&小分子化合物系列 | 大鼠胚胎干细胞培养全流程指南
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2026-04-29
背景介绍
再生医学、发育生物学与药物研发快速发展，胚胎干细胞（ESCs）成为基础研究与临床转化的核心载体。大鼠胚胎干细胞（rESCs）生理特性更接近人类，临床转化价值优于小鼠胚胎干细胞，近五年培养技术的突破，推动其在疾病模型构建、药物筛选等领域广泛应用，成为科研热点。
rESCs 源于大鼠早期胚胎内细胞团，可体外模拟胚胎发育微环境，兼具自我更新与三胚层分化能力，是研究大鼠发育机制、构建人类遗传病模型的理想细胞，近五年其多能性维持、培养体系优化等关键技术已实现突破。
rESCs 培养对环境、试剂及操作要求严苛，核心是体外模拟胚胎微环境，通过特定小分子化合物与细胞因子维持多能性。研究表明，t2i 培养条件下的低代次 rESCs 多能性更高，BMP4、CHIR-99021 等是关键试剂，合理调控浓度可显著提升培养效率。
大鼠胚胎干细胞培养所需的小分子化合物、生化试剂、细胞因子、耗材等：
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产品名称 |
货号 |
应用场景 |
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CHIR-99021 |
Wnt信号通路激活剂，维持rESCs多能性，近五年研究常用浓度2-5 μM |
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Y-27632 |
ROCK抑制剂，抑制rESCs凋亡，提升复苏及传代存活率 |
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Y-27632 dihydrochloride |
Y-27632盐酸盐，稳定性更强，适用于长期培养rESCs |
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BMP4重组蛋白 |
促进rESCs向生殖细胞分化，是诱导PGCLCs的关键细胞因子 |
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大鼠FGF-2重组蛋白 |
维持rESCs自我更新，提升多能性维持效率 |
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大鼠LIF重组蛋白 |
抑制rESCs分化，协同CHIR-99021维持多能性状态 |
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Nicotinamide 烟酰胺 |
调节rESCs表观遗传状态，减少多能性退出 |
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胎牛血清（FBS） |
40131ES/40132ES |
提供营养支持，需选择低内毒素、高纯度产品，推荐浓度10%-15% |
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DMEM基础培养基 |
rESCs培养基础体系，搭配血清及细胞因子使用 |
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HEPES溶液（1 M），细胞培养级 |
维持培养基pH稳定，适配rESCs敏感的培养环境 |
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基质胶 |
模拟体内细胞外基质，促进rESCs贴壁生长，提升多能性维持效果 |
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金属浴 |
试剂溶解、复苏加热，保障操作标准化 |
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血清移液管（5mL） |
细胞悬液转移、试剂添加，无菌操作必备 |
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吸头（10uL/200uL） |
微量试剂添加，避免交叉污染 |
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锥形离心管（15mL/50mL，无菌） |
细胞离心、悬液制备，适配rESCs离心参数 |
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24孔板，无菌 |
rESCs复苏、传代培养，每孔适宜接种密度500-1000个细胞 |
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针头过滤器（0.22um，无菌） |
培养基及试剂过滤除菌，保障培养环境无菌 |
培养方案
一. 大鼠胚胎干细胞（rESCs）的复苏
1、将储存有rESCs的冻存管从液氮中取出，迅速置于37℃水浴中2-3分钟，快速解冻。
2、将冻存管内的rESCs悬液缓慢转移至15 mL无菌锥形离心管中，加入5 mL预温至37℃的rESCs基础培养基，用血清移液管轻轻吹打2-3次，轻柔重悬细胞（避免剧烈吹打损伤细胞，影响多能性）。
3、设置离心机参数为500 g，离心3分钟，使rESCs充分沉淀，随后缓慢弃去上清液。
4、用1 mL含10 μM Y-27632（Cat# 53006ES）或Y-27632 dihydrochloride（Cat# 52604ES）的基质胶稀释液重悬rESCs，轻轻吹打2-3次至细胞分散均匀，随后加入到预铺基质胶的24孔板中，每孔加入适量重悬液，确保细胞均匀分布。
5、将24孔板放入37℃、5% CO₂、湿度70%-80%的细胞培养箱内，孵育30分钟，使rESCs贴壁。
6、制备rESCs复苏专用培养基，结合近五年研究优化配方，所需化合物如下：
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产品名称 |
货号 |
推荐浓度 |
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51402ES |
10 mM |
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53006ES / 52604ES |
10 μM |
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53003ES |
3 μM（最优浓度，兼顾多能性与增殖效率） |
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92101ES |
10 ng/mL |
7、待细胞贴壁后，每孔加入适量复苏专用培养基，覆盖细胞表面即可。
8、将培养板放回细胞培养箱，继续培养24小时，期间观察细胞形态，待细胞铺展至50%-60%汇合度，更换新鲜培养基。
1. 复苏后的rESCs培养期间，每2天更换一次新鲜的rESCs完全培养基（含CHIR-99021（Cat# 53003ES）、LIF（Cat# 92111ES）、FBS等核心成分），弃去旧培养液时动作轻柔，避免损伤贴壁细胞。
2. 培养过程中每日在显微镜下观察细胞形态，rESCs呈克隆状生长，边缘清晰、细胞排列紧密，若出现细胞分化（克隆边缘模糊、细胞形态不规则），及时更换培养基并调整培养条件（可适当提高LIF浓度）。
3. 结合2022年南开大学研究成果，培养期间可加入适量烟酰胺，抑制Thop1基因表达，减少rESCs多能性退出，维持细胞多能性状态。
4. 持续培养3-5天，待细胞汇合度达到80%-90%时，即可进行传代操作（避免细胞过度汇合导致分化）。
1、在显微镜下确认rESCs生长状态良好，无分化、无污染，24孔板每孔细胞汇合度达到80%-90%。
2、弃去每孔旧培养液，用无菌PBS（Cat# 41403ES）溶液润洗细胞表面1-2次，去除残留培养基。
3、每孔加入适量0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（Cat# 40127ES），覆盖细胞表面，放入37℃培养箱中孵育3-5分钟，显微镜下观察到细胞变圆、间隙增大时，立即加入含10% FBS(40131ES或40132ES）的培养基终止消化。
4、用血清移液管轻轻吹打细胞，使细胞从培养板底部脱落，形成均匀的细胞悬液，吹打时避免产生气泡。
5、将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中，500 g离心3分钟，弃去上清液。
6、用rESCs传代培养基重悬细胞，轻轻吹打2-3次，调整细胞密度至适宜浓度（每孔接种500-1000个细胞）。
7、将重悬后的细胞悬液加入到预铺基质胶的24孔板中，轻轻晃动培养板，使细胞均匀分布。
8、将培养板放入细胞培养箱，37℃、5% CO₂、湿度70%-80%条件下培养，24小时后观察细胞贴壁及生长情况，更换新鲜传代培养基。
9、传代后的rESCs可连续培养1-2周，期间定期更换培养基，根据细胞生长状态调整传代频率（一般3-5天传代一次）。
图1. 大鼠单倍体胚胎干细胞（RahESCs）的建系及验证(A) 建系流程：从 PN 期合子移除雌原核，经体内发育为单倍体囊胚，体外建系后通过 FACS 分选获得单倍体细胞。(B) 免疫荧光验证单原核胚胎构建成功。(C) 明场观察各阶段（PN 期胚胎、单倍体囊胚、外植生长、单倍体 ES 细胞）的形态[3]。
参考文献
1. Oikawa M, Kobayashi H, et al. Functional primordial germ cell-like cells from pluripotent stem cells in rats. Science. 2022 Apr 8;376(6589):176-179. doi: 10.1126/science.abl4412. Epub 2022 Apr 7. PMID: 35389778.
2. Xu M, Zhao Y, et al. Genome-scale screening in a rat haploid system identifies Thop1 as a modulator of pluripotency exit. Cell Prolif. 2022 Apr;55(4): e13209. doi: 10.1111/cpr.13209. Epub 2022 Mar 11. PMID: 35274380; PMCID: PMC9055895.
3. Li W, Li X, et al. Genetic modification and screening in rat using haploid embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 2014 Mar 6;14(3):404-14. doi: 10.1016/j.stem.2013.11.016. Epub 2013 Dec 19. PMID: 24360884.
4. Li X, Cui XL, et al. Generation and Application of Mouse-Rat Allodiploid Embryonic Stem Cells. Cell. 2016 Jan 14;164(1-2):279-292. doi: 10.1016/j.cell.2015.11.035. PMID: 26771496.
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