导读

从人体肠道到土壤根系，从海洋沉积物到活性污泥——微生物群落（Microbiota）无处不在。据估计，自然界中超过99%的微生物无法通过传统的分离培养技术获得纯培养，这使得大量环境微生物长期游离于研究视野之外。高通量测序（NGS）技术的成熟，使研究者能够绕开培养过程，直接解析微生物群落的物种组成、进化关系及功能潜力。本文将系统梳理菌群结构分析的NGS技术原理、应用场景、实验流程，助您从海量数据中解码微生物群落的“生态密码”。

图1 不同生境的核心菌群结构（图片来源：网，侵删）

一、背景：

微生物群被定义为占据特定环境的微生物集合，包括细菌、真菌、古菌和病毒。传统研究方法依赖分离培养，但自然界中绝大多数微生物无法在实验室条件下生长，导致研究视野严重受限。

随着高通量测序技术的发展，菌群结构分析已形成三条核心技术路径，互为补充，构建从"谁在"到"在做什么"的完整认知链条。16S/18S/ITS扩增子测序：靶向核糖体RNA基因特定区域，快速、经济地解析细菌/古菌（16S）、真核微生物（18S）和真菌（ITS）的物种组成； 宏基因组测序（Shotgun Metagenomics）：全基因组鸟枪法测序，同时获取物种分类和功能基因信息，实现种甚至株水平分辨率； 宏转录组测序（Metatranscriptomics）：以RNA为研究对象，反映活跃表达的微生物及其功能，区分"存在"与"活跃"。

二、技术应用：覆盖群落结构分析的核心场景

1. 人体微生物组与疾病关联研究

肠道菌群被誉为"第二基因组"，其结构紊乱与代谢性疾病、炎症性肠病、肿瘤等密切相关。NGS技术可精准刻画：疾病标志物发现：Ⅱ型糖尿病患者表现为产丁酸菌（Faecalibacterium、Roseburia）减少、条件致病菌富集；溃疡性结肠炎患者Enterobacteriaceae扩张、Romboutsia等有益菌减少； 菌株水平分辨率：2024年Nature Medicine研究通过8,117例宏基因组数据，发现Prevotella copri不同菌株在支链氨基酸合成能力上存在显著差异，特定菌株与胰岛素抵抗密切相关； 干预响应监测：益生菌、粪菌移植、饮食干预前后的菌群结构动态变化，评估治疗效果。

2. 环境微生物群落结构与功能解析

土壤、水体、沉积物等环境样本的菌群结构分析，是生态学和生物地球化学研究的核心：多样性基线调查：不同土地利用方式（耕地、林地、湿地）、污染胁迫（重金属、农药）下的菌群响应规律； 生物指示与修复评估：筛选污染指示类群，追踪生物修复过程中功能菌（如脱氮菌、降解菌）的定植效率； 极端生境挖掘：盐碱地、酸性矿排水、深海热液等极端环境的独特菌群资源。

3. 工业发酵过程监控与优化

食品、制药、能源工业中的微生物发酵过程，依赖核心功能菌群的稳定与高效：发酵剂质控：酸奶、酱油、白酒等发酵食品的微生物指纹库建立，识别关键功能菌与腐败菌； 过程监控：实时监测发酵过程中菌群结构的演替规律，预警杂菌污染； 合成菌群设计：基于共现网络分析构建简化功能菌群，提升发酵效率与产品稳定性。

4. 医病原微生物检测与溯源

临床样本（血液、脑脊液、组织）中的病原微生物检测，要求快速、精准、全面：无偏倚筛查：mNGS不依赖培养、无需预设靶标，可同时检测细菌、真菌、病毒及寄生虫； 溯源分析：全基因组测序（WGS）通过SNP分型实现菌株水平溯源，追踪感染源和传播链； 抗性监测：宏基因组筛查抗生素抗性基因（ARGs）及其可移动遗传元件，指导临床用药。

三、常见实验步骤

1. 样本采集与保存

人体样本：

粪便：无菌采集，液氮速冻后-80℃保存，避免反复冻融；

肠道内容物/活检组织：无菌操作，液氮保存；

口腔/皮肤拭子：无菌拭子采集，-20℃短期保存，-80℃长期保存。

环境样本：

土壤：去除表层杂质，采集0-20 cm根际土，过2mm筛，液氮速冻；

水体：根据浊度选择过滤体积（清洁水>2L，浊水0.5-1L），0.22μm滤膜富集，干冰运输；

沉积物/污泥：无菌采集，液氮速冻或-80℃保存。

2. 核酸提取

DNA提取：环境样本富含腐殖酸、重金属、多酚等PCR抑制剂，提取质量直接影响建库成败。建议采用机械裂解（0.1 mm锆珠震荡）+化学裂解双重破壁，确保有效提取。

RNA提取：宏转录组对RNA完整性和纯度要求更高：全程在无RNase环境下操作，使用DEPC处理耗材。提取后RNA需检测OD260/280及完整性。

3. 文库构建

根据测序目标选择建库策略：

16S/ITS扩增子建库：采用两步PCR法，靶向V3-V4区或ITS等区域。

宏基因组建库：采用酶切法或超声打断片段化DNA，经末端修复、加A尾、连接接头后PCR扩增。也可以基于Tn5转座酶的“一步法”建库试剂盒可在2.5小时内完成建库，起始量低至1 ng。

宏转录组建库：流程相对复杂：

rRNA去除：总RNA中rRNA占比超过90%，需通过探针杂交去除。

链特异性建库：逆转录合成cDNA第一条链后，第二链合成时以dUTP取代dTTP，保留链方向信息。链特异性文库可提供更精准的基因定量和反义转录本信息。

扩增与纯化：PCR扩增后磁珠纯化，质检合格后上机。

4. 高通量测序

扩增子测序：Illumina /MGI平台，PE250或PE300模式，每个样本建议5-10万条序列。

宏基因组测序：Illumina /MGI平台，PE150模式，数据量10-20 Gb/样本。

宏转录组测序：建议数据量10-20 Gb/样本，以覆盖低丰度转录本。长读长平台（Oxford Nanopore）可实现RNA直接测序，避免逆转录引入的偏向性。

5. 生物信息分析

核心分析内容：

质控与去噪：FastQC、cutadapt、DADA2

物种注释：SILVA、Greengenes、Kraken2、MetaPhlAn4

功能注释：PICRUSt2、HUMAnN3、KEGG、COG

抗性基因分析：ARGs-OAP v3.0

高级分析：共现网络（Cytoscape）、环境因子关联（RDA/CCA）、物种-功能关联：将转录本同时注释物种来源和功能，解析“谁在表达什么基因”。

四、总结

菌群结构分析NGS技术已突破培养限制，实现从物种组成到功能网络的全景解析。16S扩增子、宏基因组与宏转录组三条技术路径互为补充，分别回答"谁在""能做什么""正在做"的科学问题。随着长读长测序普及、多组学整合深化及AI辅助分析成熟，菌群研究正从描述走向预测与设计，为医学诊疗、农业生产与生态保护提供精准的分子导航。

【翌圣生物·菌群结构分析NGS完整解决方案】