植物体内生活着一类特殊的微生物——内生菌（Endophyte），它们在植物组织内度过部分或全部生命周期，而不会对宿主造成病害。这些微生物是种类和功能十分丰富的资源宝库，在促进植物生长、增强抗逆性、产生天然活性产物等方面发挥着关键作用。然而，传统培养法仅能分离极少部分内生菌，绝大部分“暗物质”长期无法被认知。高通量测序（NGS）技术的成熟，正在彻底改变植物内生菌研究的范式，使研究者能够从宏观群落组成到微观基因功能，全方位解码植物微生态的奥秘。本文将系统梳理NGS在植物内生菌研究中的技术原理、应用场景、标准流程及未来趋势。

图1  植物内生菌与宿主的作用机制（图片来源：网络，侵删）

一、背景：内生菌研究进入“分子全景时代”

植物内生菌（Plant Endophytes）是指生活在健康植物组织内部（根、茎、叶、花、果实、种子）且不引起宿主明显病害症状的微生物群体，包括细菌、真菌和放线菌等。早在19世纪中叶，De Bary首次提出植物体内微生物的概念；但直到21世纪，随着分子生物学技术的发展，内生菌才真正从"可培养的幸运儿"走向"全谱系的微生物组"。

传统研究依赖平板分离和形态鉴定，但面临三重困境： 培养偏差：可培养微生物仅占环境微生物的0.1%-1.0%，大量难培养菌（如厌氧菌、寡营养菌）被遗漏； 宿主干扰：植物组织富含叶绿体、线粒体DNA，严重干扰微生物DNA的检测； 功能黑箱：即使分离到菌株，其体内真实功能与互作机制仍难以解析。

NGS技术的突破彻底改变了这一局面。通过16S rRNA/ITS扩增子测序、宏基因组（Shotgun Metagenomics）和宏转录组（Metatranscriptomics）技术，研究者能够：无偏倚地解析内生菌的物种组成与多样性；直接获取不可培养菌的基因组信息；原位揭示植物-微生物互作的分子机制。目前，NGS已成为植物内生菌研究的标准配置，推动该领域从"描述性分类"迈向"机制性解析"和"工程化应用"。

二、技术应用：覆盖从基础到应用的全场景解析

1. 内生菌群落时空多样性研究

NGS技术揭示了关于寄生在植物组织中的各种微生物的丰富信息，现已广泛地应用于植物内生菌时空多样性研究。不同生长阶段的动态变化：植物在不同的生长阶段具有不同的内生菌多样性。一项关于茶树内生菌群落随时间动态变化的研究发现，老叶比新叶具有更丰富的内生真菌多样性，推测可能与植物自身生产发育周期所需的营养物质和抗病抗虫能力有关。不同产地的群落差异：对新疆、内蒙古、山西、陕西、甘肃6个产地的沙棘种子进行16S rRNA和ITS2高通量测序，揭示了不同产地沙棘种子内生细菌和真菌的菌群结构与多样性差异，为后续研究沙棘种子内生菌的生物活性提供了基础。

2. 内生菌群落功能特性研究

使用NGS技术可以全面分析植物内生菌基因功能，探索内生菌对宿主植物的正向反馈作用。促生与抗逆机制：印度梨形孢是一种著名的植物根系内生菌。采用高通量RNA-Seq方法研究其对高盐胁迫的转录反应，在对照和处理样本之间共检索到661个差异表达基因（DEGs）。富集分析结果表明，DEGs特异性参与了对盐胁迫的反应，涉及细胞壁完整性、甾醇生物合成和氧化应激等通路。

3. 环境胁迫响应研究

内生菌可以帮助宿主植物在环境条件变化时作出适应性反应。干旱胁迫研究：对干旱胁迫下马铃薯叶片内生细菌的研究显示，干旱处理下马铃薯叶片种群获得的OTU数量（2006个）多于正常浇水处理（1548个），注释到的细菌属（653属）也多于正常处理（553属）。在门水平上，变形菌门是绝对优势菌门。这表明干旱胁迫改变了内生菌群落结构，内生菌可能在抗旱性中发挥作用。

4. 合成微生物群落（SynCom）设计与应用

从"识别功能菌"到"设计功能菌群"，NGS数据正指导合成微生物群落的理性构建。通过共现网络分析（Co-occurrence network）识别核心菌群（keystone species），结合培养组学（culturomics）分离关键菌株，可构建具有特定功能的简化菌群。例如，将假单胞菌与芽孢杆菌按特定比例组合，可协同促进白杨在贫氮土壤中的生长。

三、常见实验步骤：突破"高宿主背景"的技术挑战

植物内生菌NGS研究的核心难点在于：样本中宿主植物DNA占比超过95%，而微生物DNA含量极低且片段化严重。因此，实验流程需在常规基础上进行针对性优化。

1. 样本采集与前处理

植物样本的表面消毒是内生菌研究中十分重要的环节，不彻底的表面消毒无法排除植物样本表面微生物的干扰。

组织分离：采集健康植物组织（根、茎、叶等），立即用无菌水冲洗去除表面杂质； 表面消毒：采用"酒精-次氯酸钠-酒精"三步法（如75%乙醇1min → 2.5%次氯酸钠5min → 75%乙醇30s），彻底杀灭表面附生微生物，无菌水冲洗5次； 验证涂板：将最后一次冲洗液涂布于LB或PDA平板，37℃培养48h，确认无微生物生长，证明表面消毒彻底； 保存：液氮速冻后转移至-80℃，避免反复冻融。

2. 微生物富集与核酸提取

组织破碎：植物组织坚硬且富含纤维，需采用液氮研磨，确保内生菌充分释放；

DNA提取：推荐使用磁珠法试剂盒，配合专用抑制剂去除技术，确保A260/280在1.8-2.0之间； RNA提取：宏转录组对RNA完整性和纯度要求更高：

全程在无RNase环境下操作，使用DEPC处理耗材。提取后RNA需检测OD260/280及完整性。

3. 目标区域扩增与文库构建

根据测序目标选择建库策略：

16S/ITS扩增子建库：采用两步PCR法，靶向16S rRNA基因区或ITS等区域。

宏基因组建库：采用酶切法或超声打断片段化DNA，经末端修复、加A尾、连接接头后PCR扩增。也可以基于Tn5转座酶的“一步法”建库试剂盒可在2.5小时内完成建库，起始量低至1 ng。

宏转录组建库：流程相对复杂：

rRNA去除：总RNA中rRNA占比超过90%，需通过探针杂交去除。

宏转录组建库：逆转录合成cDNA第一条链后，第二链合成、片段化、接头连接、文库扩增。

4. 高通量测序

扩增子测序：Illumina /MGI平台，PE250或PE300模式，每个样本建议5-10万条序列。

宏基因组测序：Illumina /MGI平台，PE150模式，数据量10-20 Gb/样本。

宏转录组测序：Illumina /MGI平台，PE150模式，建议数据量10-20 Gb/样本，以覆盖低丰度转录本。

5. 生物信息分析

扩增子数据分析：

质控与去噪：对Reads拼接过滤，DADA2进行ASV推断或按97%相似性聚类OTU

物种注释：16S数据用SILVA、Greengenes数据库；ITS数据用UNITE数据库

多样性分析：α多样性（Chao1、Shannon指数）、β多样性（Bray-Curtis距离、PCoA分析）

差异物种筛选：LEfSe、DESeq2识别不同条件下的差异微生物

统计分析：采用SPSS等软件进行方差分析

宏转录组/宏基因组数据分析：

质控与去宿主：去除宿主植物来源的reads

物种注释：Kraken2、MetaPhlAn4

功能注释：KEGG、GO、COG数据库比对

差异表达分析：DESeq2或edgeR识别差异表达基因

富集分析：揭示代谢通路变化

三、总结：

NGS技术已在植物内生菌研究领域完成从"前沿工具"到"常规手段"的转变。其核心价值在于将不可培养的内生菌世界转化为可量化、可比较、可操作的基因资源库。

当前技术发展呈现三大趋势：分辨率升级：从短读长V区到全长16S，从物种分类到菌株分型，鉴定精度不断突破； 多组学融合：16S/ITS与宏基因组、宏转录组、代谢组整合，构建"基因-功能-代谢"的完整链条； 合成生物学应用：从"发现菌"到"设计菌"，基于NGS数据理性构建合成菌群，开发微生物肥料、生物农药、天然产物细胞工厂。

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