宏基因组学（Metagenomics）作为探索微生物群落结构、功能及进化关系的核心技术，能够直接从环境样本中提取核酸进行进行测序和功能分析，突破了传统培养技术的限制，实现了对微生物群落“全景式”的解析，已广泛应用于环境监测、临床医学及工业生产等领域。

宏基因组学的研究核心是“微生物”：可以揭示微生物群落结构与多样性：解析特定环境中（如人体肠道、土壤、海洋）所有微生物的种类、组成和丰度；发掘微生物功能基因：探索与物质代谢、能量循环、疾病发生等相关的功能基因和代谢通路；发现新物种与新基因：从不可培养的微生物中挖掘全新的遗传资源；关联微生物与表型：研究微生物群落变化与宿主健康、疾病、环境变化之间的关系。

在宏基因组学研究中，从复杂样本（如粪便、痰液、组织、血液等）中提取的核酸，通常包含来自宿主（如人体、动物、植物）和微生物（细菌、病毒、真菌、古菌等）的混合遗传物质，是否去除宿主核酸，在哪一步中去除宿主的核酸或核酸信息是构建实验与分析流程的核心决策之一。这是因为宿主核酸对宏基因组分析的影响有：

1. 测序数据浪费：人类微生物组计划（Human Microbiome Project）的关键发现表明，在未去除宿主的样本中，高达99%的测序读长（reads）对应宿主基因组，仅有不到1%为微生物来源。这意味着测序成本大幅增加（需增加测序深度以获得足够的微生物覆盖）和有效数据量极低，影响统计效力。
2. 分析深度受限：宿主背景导致微生物基因组覆盖度不足，难以进行宏基因组组装（MAGs）、稀有物种（rare species）和低频突变检测灵敏度下降、抗生素抗性基因（ARGs）和毒力因子的检测能力受限。
3. 计算资源消耗：宿主序列的比对和过滤需要大量生物信息学计算资源，延长分析周期。实证数据：在BALF样本中，常规mNGS的宿主读长比例为97.2%，而去宿主处理后降至39.7%（HDA-mNGS）和27.4%（HDA-Nanopore），微生物读长分别提升至18.8%和61.1%。

图：宿主DNA去除对呼吸道样本宏基因组测序的影响。左图显示高宿主含量样本（BAL、鼻咽拭子、痰液）中宿主与微生物的比例；右图显示物种丰富度与微生物读长数的关系曲线，表明宿主去除可显著提高有效测序深度。

以人源性样本为例，不同样本中宿主含量差异显著，人类唾液、鼻腔和阴道样本中宿主数据占比超过90%，皮肤样本介于40% - 80%，当脑脊液中的人类细胞计数超过每立方毫升200个细胞时，这种高宿主DNA背景可能会压倒病原体信号，降低宏基因组NGS检测的敏感性。但并非所有样本都需去宿主，例如，人粪便样本中一般人的数据占比<10%，如果研究目的并非针对低丰度微生物，可考虑不进行去宿主处理，以简化实验流程。

目前绝大部分样本都希望采用去除宿主核酸的实验方案，去除的必要性主要取决于样本类型和研究目的：① 临床样本（血液、脑脊液、组织等）、宿主关联样本（动物肠道、植物根际），因宿主核酸占比极高，建议宿主核酸去除；② 环境样本（土壤、水体），若宿主核酸占比低（<10%），且研究目的为微生物多样性初步分析，可无需去除；若需进行低丰度微生物检测或功能基因挖掘，建议去除宿主核酸；③ 工业发酵样本，因宿主核酸占比极低，通常无需去除。

样本类型	宿主核酸占比	去除必要性	核心原因
临床样本（血液、脑脊液）	90%~99.9%	建议去除	宿主核酸严重干扰病原微生物检出，降低测序数据利用率
动物肠道/植物根际样本	50%~90%	建议去除	提高微生物序列占比，确保群落分析与功能注释准确性
土壤/水体环境样本	<10%	可选去除	低占比宿主核酸对研究影响较小，按需选择
工业发酵样本	<5%	无需去除	宿主核酸占比极低，不影响研究结果

宿主DNA去除的核心是利用宿主细胞与微生物细胞的理化性质差异（如细胞大小、细胞壁结构、核酸甲基化模式），或宿主DNA与微生物DNA的序列差异，实现二者的分离或特异性降解。

（1）选择性裂解法（Differential Lysis）：目前业内主流方案，原理是基于宿主细胞与微生物细胞的细胞壁/细胞膜结构差异，采用特定的裂解条件（如化学试剂、酶解），选择性裂解宿主细胞，释放宿主DNA后将其去除，而微生物细胞保持完整，后续提取微生物DNA即可减少宿主污染。例如，采用皂苷（Saponin）处理样本，可特异性裂解人体红细胞和组织细胞，释放人源DNA，再通过离心去除宿主细胞碎片和DNA，保留微生物细胞；或采用溶菌酶处理，仅裂解细菌细胞壁（微生物），但不影响宿主细胞，后续通过离心分离微生物细胞与宿主细胞，实现宿主DNA去除。该方法操作简单、高效，宿主DNA去除率可达90%以上，适用于临床样本、动物肠道样本等，且对微生物多样性影响较小。

（2）甲基化敏感酶切法：原理是大多数真核生物（宿主）的DNA存在甲基化修饰（如CpG甲基化），而原核生物（微生物）的DNA甲基化水平极低或无甲基化，利用甲基化结合蛋白或甲基化特异性抗体，特异性结合宿主甲基化DNA，通过磁珠分离将其去除，保留未甲基化的微生物DNA。该方法宿主DNA去除率高（可达95%以上），特异性强，适用于高宿主核酸占比的样本（如临床组织样本），但成本较高，操作复杂，且可能导致部分甲基化的微生物DNA被误去除。

（3）杂交捕获法：原理是设计宿主DNA特异性探针（如人源基因组特异性探针），与提取的总DNA进行杂交，探针与宿主DNA结合后，通过磁珠捕获（如生物素-亲和素磁珠）将宿主DNA分离去除，保留微生物DNA。该方法特异性强，可针对性去除特定宿主的DNA，适用于单一宿主来源的样本（如人源临床样本、小鼠模型样本），但探针设计成本高，且对低丰度宿主DNA的去除效果有限。

（4）核酸酶降解法：原理是利用核酸酶的特异性，选择性降解宿主DNA，而不影响微生物DNA。例如，SAN核酸酶可特异性降解线性的宿主DNA，而微生物DNA通常为环状（如细菌质粒、真菌线粒体DNA），可抵抗核酸酶降解，通过核酸酶处理后，离心去除降解的宿主DNA片段，保留微生物DNA。研究表明，采用皂苷结合SAN核酸酶处理血液样本，可有效去除宿主DNA，宿主DNA去除率可达89%以上，且能有效保留微生物DNA的完整性。该方法操作简单、高效，适用于多种样本类型，但对核酸酶的特异性要求较高，需避免微生物DNA被降解。

（5）差速离心法：原理是利用宿主细胞与微生物细胞的密度差异，通过不同转速的离心，实现二者的分离。例如，低速离心（500~1000r/min）可沉淀宿主细胞（如人体细胞、植物细胞），高速离心（10000~15000r/min）可沉淀微生物细胞，通过分步离心，可获得纯净的微生物细胞，进而提取微生物DNA，减少宿主DNA污染。有研究发现差速离心后加DNA酶消化对宿主核酸去除有一点的效果，推测这可能与游离的宿主核酸被DNA酶消化相关。

（6）过滤法：原理是利用不同孔径的滤膜，根据宿主细胞与微生物细胞的大小差异，实现分离。例如，人体红细胞直径约7~8μm，细菌细胞直径约0.5~5μm，可选择0.22~0.45μm孔径的滤膜，过滤样本时，微生物细胞可通过滤膜，而宿主细胞被截留，从而去除宿主细胞（及宿主DNA）。该方法操作简单、成本低，适用于血液、尿液等液体样本，但对细胞大小相近的宿主细胞（如宿主巨噬细胞）和微生物细胞（如真菌）分离效果较差，且可能导致部分微生物细胞丢失，影响微生物多样性分析。

（7）生物信息学去除法（辅助方法）：此类方法属于“干实验”去除，不改变样本中的核酸组成，而是在测序后，通过生物信息学分析，将测序数据与宿主参考基因组进行比对，去除比对上的宿主序列，保留未比对的微生物序列，用于后续分析。存在明显局限性：一是需要大量的测序数据（弥补宿主序列占据的比例），增加测序成本；二是无法去除与宿主序列同源性高的微生物序列，可能导致假阴性结果；三是对低丰度微生物，可能因测序数据不足而无法检出，因此仅适用于宿主核酸占比极低的样本，或作为湿实验去除法的辅助手段。

宏基因组研究中，核酸提取阶段的宿主核酸DNA去除并非“一刀切”，而是需根据样本类型和研究目的综合判断：高宿主核酸占比的临床样本、宿主关联样本，必须进行宿主核酸去除，否则会严重影响文库构建效率、测序数据质量及后续分析准确性；低宿主核酸占比的环境样本、工业发酵样本，可根据研究需求选择是否去除。

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