许多生化反应，例如ATP水解、DNA和RNA聚合、腺苷酸环化酶形成的环AMP和脂肪酸的酶促活化以形成它们的辅酶A酯，都能产生焦磷酸盐(PPi)，PPi能被无机焦磷酸酶水解。翌圣焦磷酸(PPi)荧光检测试剂盒采用最可靠的焦磷酸盐分光光度测定方法，使用专有的荧光PPi感受器(Ex/Em=316/456 nm)测定样本PPi的含量，相对于传统的酶偶联方法更简单、更稳定，是筛选酶活性或酶抑制剂的理想方法。
该试剂盒已经成功用于高通量筛选，适用于多种样本，如：尿液、血清、血浆、细胞培养提取物、组织裂解物等。
产品组分
| 组分编号 | 组分名称 | 组分规格 |
| 50115-A | Assay Buffer | 25 mL×1 |
| 50115-B | PPi Sensor (Lyophilized) | 1 vial |
| 50115-C | Pyrophosphate Standard | 1 mL×1, 50 mM |
| 50115-D | DMSO | 200 μL×1 |
注意事项
- 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
- 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
- 粉末溶解前请先短暂离心，以保证产品全在管底。
- 请勿吸入、吞咽或者直接接触皮肤和眼睛。
- 本产品仅用于科研用途。
实验过程
1、试剂准备
① 200× PPi Sensor母液：将50 μL DMSO（D组分）加入PPi Sensor (Lyophilized)（B组分）中制备200× PPi Sensor母液，分装-20°C避光保存，避免反复冻融。25 µL 200× PPi Sensor母液足以用于一块96孔板。
② PPi标准液(1 mM)：向10 μL的50 mM焦磷酸盐标准溶液（C组分）加入490 μL ddH2O或50 mM Hepes缓冲液(pH 7)，得到1 mM PPi标准溶液。
③ PPi标准液(PS7 - PS1)：向50 μL的1mM焦磷酸盐标准溶液加入450 μL ddH2O或50 mM Hepes缓冲液(pH 7)，得到100 μM PPi标准溶液(PS7)。取100 μM PPi标准溶液，用ddH2O或50 mM Hepes缓冲液(pH 7)进行1：3连续稀释，得到连续稀释的焦磷酸盐标准品(PS6-PS1)。
④ PPi Sensor工作液：25 μL的200× PPi Sensor母液加入5 mL的Assay Buffer（组分A，用前恢复至室温），充分混合以制备PPi工作液。
【注】：由于该检测方法对PPi具有高灵敏度，因此必须使用不含PPi的实验室器具和试剂。DTT ≥ 1 mM会增加背景，MgCl2 ≥ 2 mM会抑制反应。
2. 根据表1和2中提供的布局向黑色96孔板中加入50 μL PPi标准品(PS)、空白对照品(BL, Assay buffer only)或测试样本(TS)。对于384孔板，每孔加入25 μL。
【注】：建议尿液样品可考虑稀释1-10倍，血清和血浆样品可考虑稀释2-20倍后再进行检测，具体稀释倍数根据具体实验情况而定。
Table 1. Layout of Pyrophosphate standards and test samples in a solid black 96-well microplate.
| BL | BL | TS | TS |
| PS1 | PS1 | … | … |
| PS2 | PS2 | ||
| PS3 | PS3 | ||
| PS4 | PS4 | ||
| PS5 | PS5 | ||
| PS6 | PS6 | ||
| PS7 | PS7 |
PS = Pyrophosphate Standard (PS1 - PS7, 0.13 to 100 µM), BL = Blank Control, TS = Test Sample.
Table 2. Reagent composition for each well.
| Well | Volume | Reagent |
| PS1 - PS7 | 50 μL | Serial Dilutions (0.13 to 100 µM) |
| BL | 50 μL | Assay Buffer |
| TS | 50 μL | Test sample |
3. 对于96孔板，每孔加入50 μL PPi Sensor工作液，总测定体积为100 μL/孔；对于384孔板，每孔加入25 μL PPi工作液，总测定体积为50 μL/孔。
4. 混匀后，室温孵育10-30 min。
5. 荧光酶标仪下测量荧光读值，Ex/Em = 316/456 nm (Cutoff = 420 nm)。
数据分析
从空白标准孔获得的读数用作阴性对照。从其他标准的读数中减去该值，以获得基线校正值。然后，绘制标准读数以获得标准曲线和方程。该方程可以用于计算样本中PPi含量。
【注】：荧光背景会随时间而增加，因此标准品和测试样本的荧光读值计算前需减去空白孔的荧光强度值。
图1 代表性PPi标准曲线
冰袋运输。-25~-15℃避光保存，有效期2年。
