Superoxide Dismutase (SOD) Activity Assay Kit, Hydroxylamine method 超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒,羟胺

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产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

产品简介

 

超氧化物歧化酶(SOD)是一种在生物体内广泛存在的酶,主要功能是保护细胞免受氧化应激的损伤。SOD通过催化超氧自由基(O2-)的歧化反应,将其转化为氧气(O2)和过氧化氢(H2O2)。过氧化氢相比超氧自由基,其活性较低,可以被细胞内的其他抗氧化酶等进一步分解,从而减少氧化损伤,保护细胞。高等动物细胞内一般只有存在于细胞质中的SOD即铜锌-SOD(CuZn-SOD)和存在于线粒体中的锰-SOD(Mn-SOD),低等动物、单细胞生物和植物中除了铜锌-SOD(CuZn-SOD)、锰-SOD(Mn-SOD),还有铁-SOD(Fe-SOD)。

超氧化物歧化酶活性检测试剂盒(羟胺法)通过黄嘌呤氧化酶法来测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力,该方法基于黄嘌呤及其氧化酶反应体系,能够产生超氧阴离子自由基(O2-)。这些自由基能够进一步氧化羟胺,生成亚硝酸盐。在显色剂的作用下,亚硝酸盐使溶液呈现紫红色。通过使用可见光分光光度计测量溶液的吸光度,可以间接反映亚硝酸盐的浓度。当待测样本中存在SOD时,SOD会抑制超氧阴离子自由基的生成。由于SOD的这种抑制作用,导致形成的亚硝酸盐量减少,从而使得在比色实验中,含有SOD的样本(测定管)的吸光度值低于无SOD的对照样本(对照管)。通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。

该试剂盒可测血清、血浆、脑脊液、胸水、腹水、红细胞、白细胞、血小板、心肌培养细胞、肾透析液、尿液、肿瘤培养细胞、各种动植物组织细胞、微生物等的SOD活力,且灵敏度较高,IC50=0.05 g/mL,是邻苯三酚法的18倍。
 

组分信息

 

组分编号

组分名称

规格

储存条件

备注

60741-A

试剂一

5 mL

28℃,如有结晶,热水溶解后使用

Part 1

60741-B

试剂二

5 mL

28℃

60741-C

试剂三

5 mL

28℃

60741-D

试剂四稀释液

5 mL

28℃

60741-E

试剂五

粉剂×1 支

28℃避光保存

60741-F

试剂六

粉剂×1 支

28℃避光保存

60741-D

试剂四贮备液

350 μL

-15-25

Part 2

 

储存条件

 

28℃避光保存,有效期6个月

 

使用说明

 

【注:正式测定前建议取2-3个预期差异较大的样本做预测定,使用说明中的第8条样本正常参考值为中间值,分别往上浓缩一倍和往下稀释一倍,做三只样本管一只对照管进行预试验,以确定最佳取样浓度,取抑制率在45%~50%左右的这一管的样本浓度作为最佳取样浓度。抑制率计算公式:(对照管吸光度-测定管吸光度)÷对照管吸光度×100%

1 准备仪器

分光光度计/酶标仪/半自动生化分析仪(波长为550 nm);恒温水浴箱(37℃);台式离心机;漩涡混匀器;移液器;冰乙酸(99%以上)。

2 试剂的前处理

1)试剂一的处理:使用时按1:9的体积比加蒸馏水稀释,配成试剂一应用液。

2)试剂四的处理:350 μL的贮备液与5 mL的稀释液按1∶14比例配制,用多少配多少,现配现用,配成试剂四应用液。

3)试剂五的处理:使用时加蒸馏水37.5 mL,加热至70℃以上溶解后备用,若加热过程中水分蒸发减少,补充至37.5 mL。

4)试剂六的处理:使用时加蒸馏水37.5 mL,常温溶解后备用。

5)显色剂的配制:试剂五溶液:试剂六溶液:冰乙酸以3:3:2 的体积比配制,用多少配多少。【注:试剂五、试剂六必须分开进行配制,不可将试剂五、试剂六混合后再进行配制,否则不显色

3 样品的前处理

1)血清、血浆、心肌灌流液、肾透析液、细胞培养液等样本可直接测定,如超过线性范围用生理盐水稀释后测定。

2)组织样本的前处理

准确称取动物组织重量,按重量(g):体积(mL)=1:9的比例,加入9倍体积的匀浆介质(推荐0.86%或0.9%的生理盐水),冰水浴条件下机械匀浆,3000转/分,离心10分钟,制备成10%的匀浆液。

3)高脂血症血清(浆)样本的前处理

①轻度高脂血症(外观略有混浊):加等量的生理盐水稀释,然后进行检测;

②中度高脂血症(外观混浊较明显):加等量的生理盐水,再加血清1/2量(体积比)的无水乙醇混匀,然后进行检测;

③重度高脂血症:50 μL高脂血清(浆)加生理盐水200 μL混匀,加无水乙醇150 μL,充分混匀1分钟,再加入三氯甲烷150 μL,充分混匀1分钟,3500转/分,离心10分钟,取上清检测。

4)红细胞样本的前处理

a采集新鲜血、或肝素抗凝的静脉血或动脉血50 μL,加入含有1~2 mL生理盐水的刻度离心管中,500~1000转/分,离心10分钟。

b用移液器吸去上清液(要吸干净),留沉淀的红细胞。

c在沉淀的红细胞中加入蒸馏水0.2 mL,混匀,需使红细胞充分溶解(将溶血液对光观看,呈透明状则已充分溶解)。

d加入95%乙醇0.1 mL,振荡30秒。

e加入三氯甲烷(氯仿)0.1 mL置旋涡混匀器充分抽提混匀一分钟,3500转/分,离心8分钟。此时液体分三层:上层为SOD 抽提液,中层为血红蛋白沉淀物,下层为三氯甲烷。若上清有混浊可加入少量NaCl后再离心5分钟,即可澄清。记录上清液体积,取5~20 μL,余下的红细胞抽提液可放冰箱冷冻以备后用。【注:最佳取样量要摸索,确定最佳取样量后再按下表进行正式实验。】

大、小鼠可取内眦血,用玻璃毛细管从内眦部斜向咽喉方向刺入,或者剪尾取血,将血滴在含肝素并烤干的玻片上(烤

干时温度要低于60℃),再用移液器取50 μL血,作SOD抽提。血量少时可取10~20 μL抗凝全血(做慢性动物试验,

在饲养过程中可以反复取血 5~6次)。

5)植物/药材样本的前处理

准确称取植物组织重量,按重量(g):体积(mL)=1:4的比例,加入4倍体积的匀浆介质(0.1 mol/L,pH 7.0~7.4的磷酸盐缓冲液,41403ES),冰水浴条件下机械匀浆,3500~4000 转/分钟,离心10分钟,取上清液进行测定。【注:最佳取样量要摸索,确定最佳取样量后再按下表进行正式实验。】

4 操作步骤

1)调节波长:分光光度计/酶标仪/半自动生化分析仪(比色测定波长为550 nm)。

2)按操作表依次加入各试剂。

试剂

测定管(mL)

对照管(mL)

试剂一应用液

1.0

1.0

样品/蒸馏水

样品0.05

蒸馏水0.05

试剂二

0.1

0.1

试剂三

0.1

0.1

试剂四应用液

0.1

0.1

用旋涡混匀器充分混匀,37℃恒温水浴40分钟,当室温低于20℃时孵育时间可适当延长至45分钟。

显色剂

2.0

2.0

混匀,室温放置10分钟,于波长550 nm处,1 cm光径比色杯,蒸馏水调零,比色。

5 计算公式

1)血清、血浆、心肌灌流液、肾透析液、细胞培养液等样本计算公式:

定义:每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)。

SOD活力U/mL)=对照OD值-测试OD值)÷对照OD值÷50% x 反应体系的稀释倍数 x 样本测试前的稀释倍数

2)动物组织/细胞样本计算公式:

定义:每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)。

SOD活力U/mgprot=对照OD值-测试OD值)÷对照OD值÷50% x 反应液总体积(mL)÷取样量(mL)÷相同匀浆浓度下的蛋白含量(mgprot/mL)【注:mgprot为毫克蛋白数】¸

3)植物组织匀浆中总SOD活力计算公式:

方法一(根据组织匀浆浓度进行换算)

定义:每克组织在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)。

SOD活力U/g组织湿重=对照OD值-测试OD值)÷对照OD值÷50% x 反应液总体积(mL)÷取样量(mL)÷匀浆浓度(g/mL)【注:匀浆浓度(g/mL)=组织湿重(g)/匀浆介质体积(mL)】¸

方法二(根据蛋白浓度进行换算)

定义:每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)。

SOD活力U/mgprot=对照OD值-测试OD值)÷对照OD值÷50% x 反应液总体积(mL)÷取样量(mL)÷相同匀浆浓度下的蛋白含量(mgprot/mL)【注:mgprot为毫克蛋白数】

6 取样浓度参考值

1)人血浆(血清)、1%组织匀浆胞浆一般为2倍稀释或不稀释;

2)心肌灌流液、肾透析液白细胞悬液细胞培养液一般增加取样量到100~200 μL;

3)红细胞抽提液一般要再稀释5倍;

4)小鼠血浆(血清)2.5倍左右稀释;

5)大鼠红细胞抽提液要稀释10倍左右;

6)所有样本用生理盐水或缓冲液稀释1倍后则取样量可加大1倍。

7 最佳取样浓度的调整

若百分抑制率大于60%时(曲线为平坦部分),则需将样品浓度稀释后再测试。若百分抑制率小于15%时,则需将样品量加大或用更高浓度再测。若百分抑制率大于60%或小于10%,各个测定组的结果在检验运行中常常无显著性差异。

8  样本正常参考值

物种

样本

T-SOD活力范围

参考稀释倍数

小鼠

血清/浆

110.446±21.325 U/mL

2.5倍稀释

肝组织

269.274±23.448 U/mgprot

稀释到0.25%组织匀浆浓度

脑组织

108.790±13.494 U/mgprot

稀释到1%组织匀浆浓度

肾组织

154.277±15.646 U/mgprot

稀释到0.5%组织匀浆浓度

心肌组织

174.330±19.961 U/mgprot

稀释到1%组织匀浆浓度

皮肤组织

69.01+19.95 U/mgprot

稀释到1%组织匀浆浓度

骨骼肌

101.717±12.190 U/mgprot

稀释到1%组织匀浆浓度

大鼠

血清/浆

262.786±23.240 U/mL

10倍稀释

全血

21.554±2.116 U/mgHb

/

肝组织

214.689±38.803 U/mgprot

稀释到0.25%组织匀浆浓度

肾组织

136.825±24.763 U/mgprot

稀释到0.5%组织匀浆浓度

肠组织

74.738±11.351 U/mgprot

稀释到1%组织匀浆浓度

脑皮质组织

79.037±3.996 U/mgprot

稀释到1%组织匀浆浓度

海马组织

136.863±36.472 U/mgprot

稀释到1%组织匀浆浓度

心肌组织

128.292±9.219 U/mgprot

稀释到0.5%组织匀浆浓度

肺组织

35.542±15.465 U/mgprot

稀释到2%组织匀浆浓度

脑组织

140.177±26.878 U/mgprot

稀释到1%组织匀浆浓度

血清

213.208±73.368 U/mL

/

血清

429.04+31.60 U/mL

5倍稀释

血清

123.691±20.008 U/mL

/

胃液

27.880±8.076 U/mL

/

血清

104.2+18.8 U/mL

n=100人,2倍稀释

红细胞

19246+132 U/gHb

n=40人,5倍稀释

全血

21.554±2.117 U/mgHb

/

 

注意事项

 

  1. 使试剂充分溶解,所有配制试剂可在测试前一天配好(试剂四除外),测试前试剂及样品稳定至室温后再用。
  2. 为避免误差,样品和试剂要垂直加入试管,不要加在管壁上。
  3. 水浴或气浴前要用旋涡混匀器充分混匀。
  4. 对照管建议2支,取其平均值;或每9支测定管做1支对照管。
  5. 高等动物体中只有二种CuZn-SOD与Mn-SOD,二者相加等于T-SOD;单细胞动物及植物中还含有Fe-SOD,所以同一份标本测T-SOD与Mn-SOD或者是测T-SOD与CuZn-SOD时,或者是测T-SOD与Fe-SOD时只需测其中一对即可。
  6. 使用抗凝剂收集血浆时,不能用EDTA作为抗凝剂,因为EDTA会螯合重金属酶,导致SOD活性降低。
  7. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
  8. 本产品仅作科研用途!

 

Ver.CN20241104

400-6111-883