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产品简介
谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-PX）是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶。它特异的催化还原型谷胱甘肽（GSH）对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。GSH-PX的活性中心是硒半胱氨酸，硒是GSH-PX的必需部分，每克分子酶含4克原子硒。测定GSH-PX的活力可以作为衡量机体硒水平的一项生化指标。
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）可以促进过氧化氢（H2O2）与还原型谷胱甘肽（GSH）反应生成H2O及氧化型谷胱甘肽（GSSG），谷胱甘肽过氧化物酶的活力可用其酶促反应的速度来表示，测定此酶促反应中还原型谷胱甘肽的消耗，则可求出酶的活力。反应方程式为：
，GSH-PX的活力以催化GSH的反应速度来表示，由于这二个底物在没有酶的条件下，也能进行氧化还原反应（称非酶促反应），所以最后计算此酶活力时必须扣除非酶促反应所引起的GSH减少的部分。
GSH量的测定：GSH和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸阴离子呈现较稳定的黄色，在412 nm处测其吸光度即可计算出GSH的量。
产品组分
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组分编号 |
组分名称 |
组分规格 |
储存条件 |
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60746-A |
试剂一 |
1 mL×1 |
2~8℃，用时按照100倍比例稀释配成试剂一应用液，现用现配（如取0.1 mL加蒸馏水至10 mL，按需配置即可） |
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60746-B |
试剂二 |
1 vial |
2~8℃，粉末，每瓶试剂二加蒸馏水85 -88 mL，高温加热至完全溶解，然后再与1瓶试剂三混合，配置成试剂二应用液 |
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60746-C |
试剂三 |
25 mL×1 |
2~8℃ |
|
60746-D |
试剂四 |
1 vial |
2~8℃，每瓶加蒸馏水100 mL溶解；溶解时，可置于37℃环境中加速溶解（如有需要，不是必须） |
|
60746-E |
显色剂 |
25 mL×1 |
2~8℃，避光 |
|
60746-F |
试剂六 |
1 vial×2 |
2~8℃，避光；试剂六应用液：每瓶加蒸馏水10 mL溶解，溶解后置于2~8℃避光，可保存五天 |
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60746-G |
试剂七 |
5 mL×1 |
2~8℃，试剂七应用液（标准品溶剂应用液）配制：用时按照试剂七∶蒸馏水=1∶9的比例进行稀释配置 |
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60746-H |
GSH标准品 |
1 vial×2 |
2~8℃ |
【注】试剂二应用液配置时：试剂二粉末溶解时不要用水浴锅加热，不要用隔水加热的方式（因受热较慢导致溶解困难），最好用能直接加热的设备( 如电炉、酒精灯之类的) 加热，且加热时不断搅拌；试剂二应用液配好后为过饱和溶液，室温静置冷却后，如有结晶，则取上清进行实验即可。
储存条件
2~8℃避光保存，有效期6个月。
使用说明
一. 血清（血浆）中 GSH-PX 活力的测定
1. 操作方法
- 酶促反应：(试剂一应用液提前5 min在37℃预温)
表1 加样方法
|
加样种类 |
非酶管 |
酶管 |
|
1 mmol/L GSH标准液（mL） |
0.2 |
0.2 |
|
待测血清（血浆）（mL） |
/ |
0.1 |
|
37℃预温5分钟 |
||
|
试剂一应用液（mL） |
0.1 |
0.1 |
|
37℃准确反应5分钟 |
||
|
试剂二应用液（mL） |
2 |
2 |
|
待测血清（血浆）（mL） |
0.1 |
/ |
|
混匀，3500-4000 rpm，离心10 min，取上清1 mL作显色反应 |
||
【注】1 mmol/L GSH标准液配制：测定前取1瓶GSH标准品粉末（60746-H）加到10 mL试剂七应用液（标准品溶剂应用液）中，充分溶解配成1 mmol/L GSH标准液，配好后可置于2~8℃保存1-2周。
- 显色反应
表2 加样方法
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加样种类 |
空白管 |
标准管 |
非酶管 |
酶管 |
|
标准品溶剂应用液（mL） |
1.0 |
/ |
/ |
/ |
|
20 μmol/L GSH标准液（mL） |
/ |
1.0 |
/ |
/ |
|
上清液（mL） |
/ |
/ |
1.0 |
1.0 |
|
试剂四应用液（mL） |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
|
显色剂应用液（mL） |
0.25 |
0.25 |
0.25 |
0.25 |
|
试剂六应用液（mL） |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
|
混匀，室温静置15 min后，倒入1 cm光径比色杯中，蒸馏水调零，波长412 nm处，测各管OD值 |
||||
【注】20 μmol/L GSH标准液配制：取1 mmol/L GSH溶液0.2 mL加标准品溶剂应用液定容至10 mL充分混匀配成，现用现配。
【注】正式实验前，请先进行预实验，预实验后再进行批量实验。
2. 血清中GSH-PX酶活力的计算
a. 定义：每毫升血清在37℃每分钟，扣除非酶促反应作用，使反应体系中GSH浓度降低1 μmol/L为一个酶活力单位（U）。
b. 计算公式：（液体类的样本均可按此公式计算）
C标准：显色反应中的GSH标准液浓度，20 μmol/L；
N：酶促反应体系稀释倍数，6（2.4 mL/0.4 mL，固定值）；
T：反应时间，5 min；
V样：样本取样量，0.1 mL；
N样：样本测试前稀释倍数。
3. 血清（血浆）的最佳取样浓度摸索举例
a. 样本来源：正常组大鼠眼眶取全血，肝素抗凝取血浆。
b. 样本前处理：用生理盐水将血浆按1︰1、1︰4、1︰7、1︰9、1︰14、1︰19稀释成一系列不同浓度的血浆，分别取不同浓度血浆 0.1 mL 按血清（血浆）的操作表进行检测。
c. 测定结果：通过公式：
，选取抑制率在45%-55%之间的，作为最佳取样浓度。
二. 组织、细胞、线粒体中GSH－PX活力的测定
1. 样本前处理
1）准确称取待测动物组织的重量，按重量(g)：体积(mL)=1:9 的比例，加入9倍体积的生理盐水，低温（0-4℃）条件匀浆，3500 rpm，离心10 min，取上清液待测，制备好的匀浆上清液需要测定其蛋白浓度。
2）线粒体制备及前处理：取10%的组织匀浆5-10 mL，以1000-2000 rpm，离心10 min（普通离心机或低温低速离心机），取上清液以8000-10000 rpm（低温高速离心机）离心15 min，沉淀物为线粒体（若不立即测定，可直接放-20℃或-80℃冰箱保存，3个月内可用）。往线粒体中加入0.2-0.3 mL的匀浆介质（推荐0.1 mol/L pH 7-7.4的PBS或生理盐水），冰水浴条件下超声破碎（功率：300W，3-5秒/次，间隔30秒，重复3-5次），制备好的匀浆液若比较均匀可不离心直接测定。也可采用裂解液裂解（推荐Triton X-100，1-2%浓度，0.1 mL，裂解30-40 min）,裂解好的液体可不离心直接测定，制备好的匀浆液需要测定其蛋白浓度。
3）细胞样本前处理：（贴壁细胞）用细胞刮配合等渗PBS刮下或用胰酶消化下来（消化后加入0.5-1 mL等渗PBS冲洗），再将细胞悬液转移到另一离心管中，1000 rpm，离心10 min，弃上清液，留细胞沉淀；用等渗缓冲液清洗1-2次，同样1000 rpm，离心10 min，弃上清液，留细胞沉淀（若不立即测定，可直接放-20℃或-80℃冰箱保存，3个月内可用）；往细胞沉淀中加入0.2-0.3 mL的匀浆介质（推荐0.1 mol/L pH 7-7.4的PBS或生理盐水）（加完匀浆介质后轻轻混匀细胞溶液，使其均匀，吸取少量进行细胞计数；若是破碎后可以测蛋白，则不用细胞计数），冰水浴条件下超声破碎（功率：300W，3-5秒/次，间隔30秒，重复3-5次）或手动匀浆，制备好的匀浆液若比较均匀可不离心直接测定。也可采用裂解液裂解（推荐Triton X-100，1-2%浓度，0.1 mL，裂解30-40 min），裂解好的液体可不离心直接测定。【注】：建议细胞数在100万个以上（细胞越多，测定效果越好）。破碎好的液体可显微镜观察细胞是否破碎完全。
2. 操作方法
1）酶促反应：(试剂一应用液提前5 min在37℃预温)
表3 加样方法
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加样种类 |
非酶管 |
酶管 |
|
1 mmol/L GSH标准液（mL） |
0.2 |
0.2 |
|
待测血浆（mL） |
/ |
0.2 |
|
37℃预温5分钟 |
||
|
试剂一应用液（mL） |
0.1 |
0.1 |
|
37℃准确反应5分钟 |
||
|
试剂二应用液（mL） |
2 |
2 |
|
待测匀浆（mL） |
0.2 |
/ |
|
混匀，3500-4000 rpm，离心10 min，取上清1 mL作显色反应 |
||
【注】1 mmol/L GSH标准液配制：测定前取1瓶GSH标准品粉末（60746-H）加到10 mL试剂七应用液（标准品溶剂应用液）中，充分溶解配成1 mmol/L GSH标准液，配好后可置于2~8℃保存1-2周。
【注】正式实验前，请先进行预实验，预实验后再进行批量实验。
2）显色反应
表4 加样方法
|
加样种类 |
空白管 |
标准管 |
非酶管 |
酶管 |
|
标准品溶剂应用液（mL） |
1.0 |
/ |
/ |
/ |
|
20 μmol/L GSH标准液（mL） |
/ |
1.0 |
/ |
/ |
|
上清液（mL） |
/ |
/ |
1.0 |
1.0 |
|
试剂四应用液（mL） |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
|
显色剂应用液（mL） |
0.25 |
0.25 |
0.25 |
0.25 |
|
试剂六应用液（mL） |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
|
混匀，室温静置15 min后，倒入1 cm光径比色杯中，蒸馏水调零，波长412 nm处，测各管OD值 |
||||
【注】20 μmol/L GSH标准液配制：取 1 mmol/L GSH溶液0.2 mL加标准品溶剂应用液定容至10 mL充分混匀配成，现用现配。
3. 组织中GSH-PX酶活力的计算
a. 定义：每毫克蛋白质在37℃每分钟，扣除非酶促反应作用，使反应体系中GSH浓度降低1 μmol/L为一个酶活力单位（U）。
【注】组织蛋白的测定：参照实验方法学中的考马斯亮兰法、BCA法、紫外法及磺基水杨酸法测出所取样本中的蛋白毫克数。
b. 计算公式：
C标准：显色反应中的GSH标准液浓度，20 μmol/L；
N：酶促反应体系稀释倍数，5（2.5 mL/0.5 mL，固定值）；
T：反应时间，5 min；
V样：样本取样量，0.2 mL；
Cpr：匀浆液蛋白浓度，mgprot/mL（prot 指蛋白）；
【注】：酶促反应体系如有改变，计算时实际的V样需乘以体系改变的系数（如酶促反应体系缩小2倍后，取样0.1 mL，计算时V样应为0.1 mL×2=0.2 mL）。
3. 组织（匀浆）的最佳取样浓度摸索举例
a. 样本来源：正常小鼠肝组织，加生理盐水制备成10%的肝匀浆上清待测。
b. 样本前处理：用生理盐水将10%肝匀浆稀释成0.5%、0.4%、0.3%、0.25%、0.2%、0.1%、0.05%浓度，分别取0.2 mL按组织的操作表进行检测。
c. 测定结果：通过非酶管OD值－酶管OD值在0.2左右时，作为最佳取样浓度。
三. 全血中GSH－PX活力的测定
1. 样本前处理（溶血液的配制）
1）取人肝素抗凝全血20 μL，以蒸馏水稀释至1 mL，配成1：49的溶血液；鼠血10 μL加蒸馏水至1 mL，配成1∶99的溶血液。充分混匀，放置5 min直至使玻璃管中的溶血液对光呈完全透明状，方可进行检测。
2）已配好的溶血液中GSH-PX活力只能保持45-60 min，天冷时可延迟至120 min。如果当天来不及测定则以抗凝全血冰箱（2℃-8℃）保存，2-3天内酶活力变化不大。
【注】请在正式实验前做预实验。
【注】测溶血液中GSH－PX含量要注意样品测试前红细胞一定要充分溶血。（以对光观察透亮为标准，若不透亮可以冻溶一次，但有部分大鼠及猪的红细胞是不可放置0℃以下，否则不易溶血，例如糖尿病大鼠和部分正常大鼠的红细胞冻后很难溶血。在做正式实验前最好先取1-2只样本做预实验。）
2. 操作方法
1）酶促反应：(试剂一应用液提前5 min在37℃预温)
表5 加样方法
|
加样种类 |
非酶管 |
酶管 |
|
1 mmol/L GSH标准液（mL） |
0.2 |
0.2 |
|
待测溶血液（mL） |
/ |
0.2 |
|
37℃预温5分钟 |
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|
试剂一应用液（mL） |
0.1 |
0.1 |
|
37℃准确反应5分钟 |
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|
试剂二应用液（mL） |
2 |
2 |
|
待测溶血液（mL） |
0.2 |
/ |
|
混匀，3500-4000 rpm，离心10 min，取上清1 mL作显色反应 |
||
【注】1 mmol/L GSH标准液配制：测定前取1瓶GSH标准品粉末（60746-H）加到10 mL试剂七应用液（标准品溶剂应用液）中，充分溶解配成1 mmol/L GSH标准液，配好后可置于2~8℃保存1-2周。
【注】正式实验前，请先进行预实验，预实验后再进行批量实验。
2）显色反应
表6 加样方法
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加样种类 |
空白管 |
标准管 |
非酶管 |
酶管 |
|
标准品溶剂应用液（mL） |
1.0 |
/ |
/ |
/ |
|
20 μmol/L GSH标准液（mL） |
/ |
1.0 |
/ |
/ |
|
上清液（mL） |
/ |
/ |
1.0 |
1.0 |
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试剂四应用液（mL） |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
|
显色剂应用液（mL） |
0.25 |
0.25 |
0.25 |
0.25 |
|
试剂六应用液（mL） |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
|
混匀，室温静置15 min后，倒入1 cm光径比色杯中，蒸馏水调零，波长412 nm处，测各管OD值 |
||||
【注】20 μmol/L GSH标准液配制：取 1 mmol/L GSH溶液0.2 mL加标准品溶剂应用液定容至10 mL充分混匀配成，现用现配。
3. 全血中GSH-PX酶活力的计算
a. 定义：每毫升全血在37℃每分钟，扣除非酶促反应作用，使反应体系中GSH浓度降低1 μmol/L为一个酶活力单位（U）。
b. 计算公式：
C标准：显色反应中的GSH标准液浓度，20 μmol/L；
N：酶促反应体系稀释倍数，5（2.5 mL/0.5 mL，固定值）；
T：反应时间，5 min；
V样：样本取样量，0.2 mL；
N样：全血制备成溶血液过程中的稀释倍数；
3. 溶血液的最佳取样浓度摸索举例
a. 样本来源：正常组新鲜大鼠尾部肝素抗凝全血。
b. 样本前处理：分别用蒸馏水将大鼠全血按1︰49、1︰59、1︰69、1︰79、1 ︰89、1︰99、1︰149、1︰199的比例稀释成不同浓度的溶血液，分别取0.2 mL按全血的操作表进行检测。
c. 测定结果：通过公式：
，选取抑制率在45%-55%之间的，作为最佳取样浓度。
四. 预实验相关事项
- 【注】：空白管、标准管一般只需做1—2只。酶管和非酶管每个样本都要做。
- 【注】：最佳取样量及最佳取样浓度因样品种类不同，其GSH－PX活力不一，根据酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系，各种测定样品取样量及取样浓度不一样，在每测定一种新的样品前最好选择一个最佳取样量及最佳取样浓度。
- 最佳取样浓度的摸索：测试前先预试以确定最佳取样浓度：当您第一次使用本试剂盒测试某一种新的样品时最好挑选2例样本先做三只不同浓度的测试管。例如：测全血，则分别取用蒸馏水1︰24、1︰49、1︰99稀释的溶血液200 μL进行预实验；测组织匀浆：则分别取5%、2%、1%等的匀浆200 μL进行预实验（不同样本稀释浓度不同）(动物肝脏中酶活一般较高些)；测血清：则分别取未稀释的血清及用生理盐水1︰1、1︰4、1︰9、1︰19稀释的血清100 μL进行预实验，然后进行计算：
，结果应该在15%-55%之间，然后取百分抑制率在45%或50%左右的一管作为最佳取样浓度。因为酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系，若百分抑制率大于60%时（曲线的平坦部分），则需将样品浓度稀释后再测试。若百分抑制率小于20%时，则需将样品浓度加大后测试。需要注意的是组织匀浆或其他类似样本有时本身浊度或颜色有干扰时，预实验不必通过抑制率计算，这时可以用非酶管OD值－酶管OD值在0.2左右时来判定。若百分抑制率大于60％或小于10％，各个测定组的结果在检验中有可能无显著性差异。
注意事项
1. 本产品仅作科研用途。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
3. 溶血液在室温下1小时内活力不变，建议样品稀释后不超过1小时测试为宜。
4. 血样要新鲜，肝素抗凝后放冰箱2-8℃存放不要超过48 h。
5. 测溶血液中GPX活性要注意样品测试前红细胞一定要充分溶血。（以对光观察透亮为标准，若不透亮可以冻溶一次，但有部分大鼠及猪的红细胞是不可冻溶，越冻越不破，最好先取1-2只样本做预实验）。
6. 酶促反应离心后有悬浮物无法分离时，可加入0.1 mL氯仿涡旋震荡30 s再离心。
7. 37℃水浴反应时间5 min，记录反应时间要准确。
8. 有的样本酶管OD值和非酶管OD值接近，此为样本GPX活性较低的缘故（且计算结果误差会比较大），这种情况可考虑增加样本浓度或样本量以及延长反应时间来改善测试效果。
9. 样本匀浆上清液当天提取，当天测试浓度。
10. 试剂二应用液配置时：试剂二粉末溶解时不要用水浴锅加热，不要用隔水加热的方式（因受热较慢导致溶解困难），最好用能直接加热的设备( 如电炉、酒精灯之类的) 加热，且加热时不断搅拌；试剂二应用液配好后为过饱和溶液，室温静置冷却后，如有结晶，则取上清进行实验即可。
11. 正式实验前，请先进行预实验，预实验后再进行批量实验，否则由此导致的后果用户自行承担。
Ver.CN20240829
