人载脂蛋白B(ApoB)ELISA试剂盒 Human ApoB(Apolipoprotein B) ELISA Kit（60413ES）

本试剂盒通过竞争法测定样本中载脂蛋白B（ApoB）的浓度。首先，将样本加入到预先涂有特异性抗体的酶标孔中，随后加入生物素标记的抗原。在37℃下孵育30 min，样本中的ApoB抗原与生物素标记的抗原会竞争性地结合固相抗体，形成免疫复合物。孵育完成后，用PBST缓冲液洗涤，去除未结合的生物素标记抗原。接着加入亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）复合物，再次在37℃孵育30 min，使亲和素-HRP与生物素标记的抗原结合。洗涤后，加入四甲基联苯胺（TMB）底物，结合的HRP会催化TMB显色，呈现蓝色。在酸的作用下，蓝色转变为黄色，该黄色产物在450 nm波长处有吸收峰。最终，通过测定吸光值来反映样本中ApoB的浓度，吸光值与ApoB浓度呈负相关。

翌圣生物提供大鼠载脂蛋白B(ApoB)ELISA试剂盒（60411ES）、小鼠载脂蛋白B(ApoB)ELISA试剂盒（60412ES）和人载脂蛋白B(ApoB)ELISA试剂盒（60413ES）。

组分信息

备注：

1. 浓缩洗涤液在低温下会有少量盐类析出，稍微加温后即会消失，不影响使用。
2. 酶标板为真空包装，板条可以拆卸，拆开以后如一次不能用完，可放入提供的密封袋中，放入干燥剂，2～8℃保存，在一个月之内仍然有效。
3. 试剂不能反复冻融。

本产品重复性好，准确性高，适合大规模样本分析。可用于血清、血浆、细胞培养上清等多种样本。

使用说明

1.试剂准备

1）使用前所有试剂应置于室温平衡至少30 min。

2）本试剂盒可以直接加样，如浓度过高，可以进行适当比例的稀释，计算时应将结果乘以稀释的倍数，建议先做预实验，以确定稀释倍数(以样本测定值在标曲范围内为准)。

3）洗涤液为25倍浓缩液，使用前需将所有洗涤液倒入500 mL或1 L的烧杯中，用双蒸水定容到500 mL即为工作液，或可按比例1:24配制需要量。

4) 标准品的稀释：每支标准品加150 μL标准品稀释液到标准品干粉管中，然后漩涡混匀30s，充分溶解，避免气泡，即为320 ng/mL的标准品原液(24h内用完)。取5支干净的EP管，每管加150 μL的标准品稀释液，分别标记上160 ng/mL，80 ng/mL，40 ng/mL，20 ng/mL，10 ng/mL。取150 μL标准品原液加入标记160 ng/mL的管中，混匀后同样取出150 μL，加入下一管，以此类推直至最后一管。

5) 生物素抗原的稀释：将浓缩生物素抗原(冻干粉)低速(2000-4000转/分钟)离心(2-5 min)，然后抽取生物素抗原稀释液1 mL到浓缩型生物素抗原(冻干粉)中，漩涡混匀15s，至冻干粉完全溶解，然后将所有液体倒入稀释液瓶中，漩涡混匀后即为生物素抗原工作液(一周内用完)。

6) 亲和素-HRP的稀释：将亲和素-HRP低速(2000-4000转/分钟)离心(2-5 min)，使浓缩液全部沉到管底，将浓缩亲和素-HRP全部转移到稀释液瓶中，漩涡混匀后即为亲和素-HRP工作液(一周内用完)。

2.样本前处理

标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-25～-15℃保存，但应避免反复冻融。

1）血清

室温血液自然凝固10-20 min，2000-3000转/分，离心20 min左右。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2）血浆

根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20 min后，2000-3000转/分，离心20 min左右。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

3）尿液

用无菌管收集，2000-3000转/分，离心20 min左右。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4）细胞培养上清

检测分泌性的成份时，用无菌管收集。2000-3000转/分，离心20 min左右。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS (pH 7.2-7.4)稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/mL左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。2000-3000转/分，离心20 min左右。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5）组织标本

切割标本后，用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2～8℃的温度。按重量体积比1 g:9 mL的比例加入9倍体积的PBS(pH7.4，41403ES)，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。2000-3000转/分，离心20 min左右。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

3.洗板方法

1) 手工洗板：先甩洗去酶标孔中的的液体，倒扣在吸水纸上拍干，然后每孔加入300 μL稀释好的洗涤液，轻轻摇晃30s，然后甩掉，在吸水纸上拍干，重复4-5次。

2) 洗板机洗板：洗板机洗板比较便捷，但应操作熟练后使用。

4.详细操作程序

1) 使用前将试剂盒在室温下平衡半小时。

2) 空白孔：空着先不加（只在最后和其它孔一起加显色剂A、B和终止液用于调零)。

3) 标准品孔：每孔加入稀释好各浓度的标准品50 μL，然后加入生物素抗原工作液50 μL。

4) 零孔：加入标准品稀释液50 μL，然后加入生物素抗原工作液50 μL。

5) 样品孔：加入样品50 μL，然后加入生物素抗原工作液50 μL。

6) 轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30 min。

7) 将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用。

8) 第一次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。

9) 加入50 μL亲和素-HRP工作液到零孔、标准品孔和样品孔中，轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30 min。

10) 第二次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。

11) 显色：每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，酶标板覆膜，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10 min左右。 提示：注意不定时观察孔板，根据每孔显色情况酌情缩短或延长孵育时间，但不可超过30 min。当标准孔出现明显梯度时（前4个孔出现明显蓝色梯度），即可终止。

12) 终止：每孔加入终止液50 μL。（注：终止液的加入顺序应尽量与显色液的加入顺序相同）

13) 测定：以空白孔调零孔，在酶标仪450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后10 min以内进行。

14) 计算：根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程，建议用专用计算软件进行计算。

5.操作总结

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2～8℃保存，有效期6个月。