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产品描述
真核生物中mRNA经转录后修饰在5'端形成一个特殊结构，即帽子结构，该结构对mRNA的稳定、转运与翻译过程均有较重要作用。牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子结构的有效酶，其由D1和D12两个亚基组成，兼具RNA三磷酸酯酶活性、鸟苷酰基转移酶活性和鸟嘌呤甲基转移酶活性，可将7-甲基鸟嘌呤帽结构（m7Gppp）连接到RNA的5'末端（m7Gppp5'N）。牛痘病毒加帽酶，在合适浓度的加帽缓冲液（Capping buffer），鸟苷三磷酸（GTP），S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等存在条件下，能够在一个小时之内对RNA进行加帽，并且保证正确的方向。
本品以无菌液体形式提供，可应用于体内/体外翻译前mRNA的加帽反应或mRNA的5'末端标记反应。
产品性质
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来源（Source） |
携带牛痘病毒加帽酶基因的E. coli |
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最适温度（Optimum Temperature） |
37℃ |
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储存缓冲液（Storage Buffer） |
20mM Tris-HCl pH 8.0，100 mM NaCl，1 mM DTT，0.1 mM EDTA，0.1% Triton X-100，50%甘油 |
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活性单位定义（Unit Definition） |
37℃条件下，1小时内将10 pmol GTP（α- 32P）掺入到一条含80个核苷酸（80nt）转录产物上所需要的酶量，即为1个单位。 |
产品组分
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组分编号 |
组分名称 |
产品编号/规格 |
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10615ES76 （500 U） |
10615ES84 （2000 U） |
10615ES92 （10000 U） |
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10615-A |
10×Capping Buffer |
150 μL |
500 μL |
1.25 mL×2 |
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10615-B |
Vaccinia Capping Enzyme（10 U/μL） |
50 μL |
200 μL |
1 mL |
运输和保存方法
干冰运输。 -15℃ ~ -25℃保存，有效期一年。推荐分装保存，避免反复冻融。
使用方法
加帽反应（反应体系20 μL）
本步骤适用于10μg RNA（≥ 100 nt）的加帽反应，且可根据实验需要放大。
1. 取10μg RNA至1.5 mL离心管，使用无核酸酶的水稀释至9.5 μL；
2. 65℃加热5 min；
3. 取出离心管置于冰上5 min；
4. 依次加入以下组分：
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组分 |
体积 |
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Denatured RNA |
9.5 μL |
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10×Capping Buffer |
2.0 μL |
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Murine RNase inhibitor(40 U/μL) |
0.5 μL |
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GTP (10 mM) |
1.0 μL |
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SAM (10 mM, fresh) |
1.0 μL |
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Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μL) |
5.0 μL |
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Cap 2´-O-Methyltransferase (50 U/μL) |
1.0 μL |
【注】：10×Capping Buffer(Cat# 10666)：0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT pH 8.0 @ 25°C。
5. 37°C孵育2 h；
6. RNA加帽完成，可进行后续实验。
注意事项
1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作；
2. 所提取的RNA需经过纯化并使用无核酸酶的水重悬；
3. 在加入酶之前需要对RNA溶液进行加热以去除5'末端的二级结构；
4. 对于已知5'末端结构的RNA，可以延长反应时间至4 h，提高加帽效率；
5. 5'末端标记反应体系中，GTP储液应稀释为反应体系中mRNA摩尔浓度的1-3倍。
HB220701
