大家是不是都面临这样的场景：辛苦处理的细胞，担心冻存对结果有影响，熬夜立马实验？病房外焦急等待手术样本，拿到样本后马不停蹄奔向实验台？野外采集的样本，恨不能将实验台搬到田野？

铛铛铛铛，冻存样本处理protocol放送了！

（Tips:细胞冻存或者组织冻存时，建议放在液氮中保存，这样样本存储时间更久，得到的结果更好哦！）

01

冻存细胞预处理

1.1

实验前准备

1.在开始细胞解冻前，将水浴锅设置为37℃；

2.准备约50 mL温热（37℃预热）的RPMI-1640 +10% FBS培养基；

3.离心机打开设置4℃，300 g，5 min。

1.2

冻存样本复苏实验步骤

1.从-80℃冰箱或液氮中取出冻存管，并立即于37℃水浴锅快速晃动解冻，直到冻存管内的试剂完全融化（整个过程在1-2 min内完成）。

2.从水浴中取出冻存管，用酒精棉对冻存管口及外表面进行消毒；

3.将细胞样本连同冻存液一起转移至新的15 mL离心管中，加入5 mL预热的细胞完全培养基RPMI-1640 +10% FBS，轻柔吹打将液体混合均匀；

4.室温300 g，离心5 min，弃上清（担心细胞被吸到可留5-10 μL的上清）；

5.离心后弃去上清，根据细胞量加入150 μL预冷的RPMI1640培养基重悬，取5μL 细胞悬液加入15 μL 的AO/PI染色，细胞计数及细胞活性；

6.如细胞活率大于80%，有核率大于70%，背景干净可以直接进行下游实验。（若细胞活性较低，也可正常提核，但是后续ATAC实验结果可能出现重复率不高的情况，需根据实验室自己的项目情况来具体评估）。

1.3

ATAC实验-细胞收集

1.获细胞并计数：取实验所需数量的细胞(5万左右)于 1.5 mL EP 管中，4℃ 2,300 rpm (500 × g)离心 5 min，吸净管内溶液。

【注】：对于大小不同的细胞，请根据实际情况调整离心力。

2.每个样本加入 50 μL 预冷的 Wash Buffer 重悬细胞，4℃ 2,300 rpm (500 × g)低速离心 5 min，吸净管内溶液。

3.每个样本中加入 50 μL Lysis Buffer，轻轻吹打重悬，冰上放置 5 min，4℃，2,300 rpm (500 × g)离心 5 min，去除上清。

4.直接进行后续的转座反应。

02

冻存组织预处理

样本处理

1. 将冻存小鼠肝脏组织从-80℃取出放于培养皿中，用刀片切下绿豆粒大小（约30mg）组织，随后立即将培养皿放置冰上。

2. 组织大部分融化后，加入1mL预冷的PBS清洗小鼠肝脏组织，用移液器吸去PBS，共清洗3次。

3. 清洗完成的肝脏组织可以采用以下两种处理方式提取细胞核，客户可根据实际情况自行选择。

方案一：将培养皿至于提取预冷的金属块上，在培养皿中，用刀片将组织切碎成颗粒状（芝麻大小），加入600 μL预冷的Lysis Buffer，冰上静置10 min。随后用40 μm细胞筛过滤切碎的组织至1.5mL EP管中，4℃，300 g离心5 min，去上清，用200 μL预冷的PBS重悬细胞核沉淀。取18 μL细胞核悬液，加入2 μL 0.4%台盼蓝溶液染色，显微镜下镜检，用血球计数板计算细胞核的浓度。(刀片切割：细胞核悬浮液体积200 μL，细胞核浓度约750个/μL；细胞筛研磨：细胞核悬浮液体积1000 μL，细胞核浓度约2000个/ μL)。根据计数结果，取50000细胞核悬液，加50 μL预冷的PBS，4℃，300g离心3 min去除上清，收集细胞核。
方案二：取一个干净的50 mL离心管，插入冰中，去掉管盖，将40 μm细胞筛放在管口，用镊子将培养皿中清洗完成的组织放置于细胞筛中央处。取少量预冷的PBS（200 μL左右，覆盖组织块即可）滴加到组织处，用注射器黑色的活塞头轻轻的研磨分散组织（研磨2圈后，观察组织分散情况，每研磨2圈加入500 μL-1000 μL预冷的PBS冲洗组织块，总计研磨4-6圈左右，此时，50 mL离心管中溶液呈乳白色，细胞筛表面有一层组织覆盖）。将离心管中溶液转至1.5 mL EP管中，4℃，300 g离心5 min，去上清，用600 μL预冷的Lysis Buffer重悬细胞核沉淀，冰上静置5min。4℃，300 g离心5min，去上清，用1000 μL预冷的PBS重悬细胞核沉淀，随后用40 μm细胞筛过滤重悬后的细胞核至1.5 mL EP管中。

表1-2 组织lysis buffer配方

4. 取18 μL细胞核悬液，加入2 μL 0.4%台盼蓝溶液染色，显微镜下镜检，用血球计数板计算细胞核的浓度。(刀片切割：细胞核悬浮液体积200 μL，细胞核浓度约750个/μL；细胞筛研磨：细胞核悬浮液体积1000 μL，细胞核浓度约2000个/ μL)；

5. 根据计数结果，取50000细胞核悬液，加50 μL预冷的PBS，4℃，300g离心3 min去除上清，收集细胞核；

6. 处理好的细胞核立即进行Tn5转座法DNA建库。

表1-3不同处理方式得到的细胞核

03

ATAC-seq建库实验

3.1

ATAC实验-转座酶片段化（0.5 h-1 h）

1.于无菌 PCR 管中配制表 2 所示反应体系，配制好后冰上放置；

2. 将配制好的 Transposition Mix 加入到处理好的细胞核中，使用移液器轻轻吹打 5-8 次混匀；

【注】：吹打时尽量轻柔缓慢，不要产生气泡，否则会对细胞核造成损伤。也不要离心，否则会导致细胞核聚集，导致片段化不充分。

将上述 PCR 管置于 PCR 仪中，设置表 3 所示反应程序，进行片段化反应。

4. 将反应结束后的 PCR 管瞬离，立即向每个样本中加入 5 μL 的 Terminate Solution，用移液器轻柔吹打 20 次混匀，室温静置 5 min。

3.2

ATAC实验-基因组 DNA 回收（0.5 h）

1. 将平衡至室温的 DNA Extract Beads 磁珠，涡旋振荡混匀；

2. 吸取 130 μL DNA Extract Beads 至 55 μL 终止后的片段化产物中，涡旋混匀或用移液器吹打混匀 10 次，室温静置孵育5 min；

3. 短暂离心，将离心管置于磁力架上静置 3 min，待磁珠完全贴壁后吸净 PCR 管中溶液；

4. 保持 PCR 管始终处于磁力架上，从另一侧加入 200 μL 80%乙醇，避免直接冲洗磁珠，静置 30-60 sec，吸净 PCR 管中溶液；

5. 保持 PCR 管始终处于磁力架中，再次加入 200 μL 80%乙醇，静置 30-60 sec，吸净 PCR 管中溶液；

6. 保持 PCR 管始终处于磁力架中，开盖空气干燥至磁珠刚刚出现龟裂(不超过 3 min)；

7. 从磁力架上取下 PCR 管，加入 25 μL ddH2O，并充分涡旋，室温静置 5 min；

8. 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架上分离磁珠和液体，待溶液澄清后(约 3-5 min)，小心转移 23 μL 上清至新的 PCR 管中，进行后续的文库扩增或者-20℃保存。

3.3

文库扩增（0.5 h-1h）

1. 将表 4 中试剂解冻后颠倒混匀，瞬离后置于冰上备用；

2. 于无菌 PCR 管中配制表 4 所示反应体系；

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底；

4. 将 PCR 管置于 PCR 仪中，设置表 5 所示反应程序，进行 PCR 扩增。

3.4

文库分选（0.5 h）

由于起始细胞量以及不同种类细胞的染色质开放状态差异，文库大小可能存在不同的分布模式。通过磁珠分选，文库中的大片段可以有效去除，使得文库片段分布在 200-700 bp 左右。

1. 进行双轮分选的比例推荐 0.55×/1.0×，吸取 27.5 μL (0.55×Beads:DNA=0.55:1)平衡至室温的 DNA Clean Beads 至步骤 5.5 的 PCR 反应产物中，涡旋混匀或用移液器吹打混匀 10 次，室温静置孵育 5 min；

2. 短暂离心，将 PCR 管置于磁力架上静置 5 min，待溶液澄清后，小心转移上清至新的 PCR 管中(残留 3-5 μL，避免吸到磁珠)；

3. 涡旋振荡混匀 DNA Clean Beads 并吸取 50 μL(1.0×，Beads:DNA=1:1)至上清中，涡旋混匀或移液器吹打混匀 10 次，室温静置孵育 5 min；

4. 短暂离心，将 PCR 管置于磁力架上静置 3 min，待磁珠完全贴壁后吸净 PCR 管中溶液；

5. 保持 PCR 管始终处于磁力架上，从另一侧加入 200 μL 80%乙醇，避免直接冲刷磁珠，静置 30-60 sec，吸净 PCR 管中溶液；

6. 保持 PCR 管始终处于磁力架上，再次加入 200 μL 80%乙醇，静置 30-60 sec，吸净 PCR 管中溶液；

7. 保持 PCR 管始终处于磁力架上，开盖空气干燥至磁珠刚刚出现龟裂(不超过 3 min)；

8. 从磁力架上取下 PCR 管，加入 21 μL ddH2O，并充分涡旋，室温静置 5 min；

9. 将 PCR 管短暂离心，置于磁力架上分离磁珠和液体，待溶液澄清后(约 3-5 min)，小心转移 20 μL 上清至新的 EP 管中，于-20℃保存。

3.5

文库质量控制

通常情况下，对构建好的文库进行浓度和长度分布检测，具体请参见注意事项，主要包括：

a. 浓度检测：用 Qubit 对文库的浓度进行检测。
b. 质量检测：用 Qsep 或者安捷伦 2100 检测文库片段分布。

04

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