T7 High Yield RNA Synthesis Kit 进行了转录反应体系的优化，试剂盒使用 T7 RNA 聚合酶并以含有 T7 启动子序列的线型双链 DNA 为模板，以 NTPs 为底物，对启动子下游的 DNA 序列进行转录，高效合成单链 RNA。转录时可在底物中加入修饰的核苷酸，制备生物素或染料标记的 RNA。

本试剂盒可以合成长转录本以及短转录本，以 1 μg 的模板投入量可以产生 100-200 μg 的 RNA，转录合成的 RNA 可用于诸如 RNA 结构与功能研究、RNA 酶保护、探针杂交、RNAi、显微注射及体外翻译等多方面的下游应用。

Figure 1: RNA体外转录过程

l 极高的产量—2小时内产量可以达到200 µg

l 通用—适用于20nt-10000nt RNA的转录

l 高的性能—降低IVT过程中的副产物

l 多种应用—可用于普通、标记、修饰的RNA合成

Figure 2 体外转录产量对比

Figure 3 不同长度转录产物的质量

Figure 4转录的mRNA在HEK-293细胞中的表达量

注: mRNA已经用Vaccinia Capping Enzyme(Yeasen#10614/10615)进行了加帽

A. 试剂解冻

将 T7 RNA Polymerase Mix 短暂离心置于冰上。解冻 10×Transcription Buffer 和核糖核苷酸（ATP、CTP、GTP、UTP）混匀并离心至管底，10×Transcription Buffer 置于室温，4 种核糖核苷酸置于冰上备用。

B. 室温装配转录反应

按下列体系配制反应体系

注：

1. 反应于室温配置。由于10×Transcription Buffer中含有亚精胺，低温下亚精胺浓度过高会引起 DNA 模板沉淀。

2. 短转录本（<100 nt），模板可使用 2 ug，转录时间增至 4-8 个小时。

3. 长转录本（>1000 nt），建议使用质粒线性化模板进行转录。

4. 建议在 PCR 仪中进行反应，热盖打开，防止长时间导致反应液蒸发。

5. 反应产物可能有白色沉淀。这是反应过程中游离的焦磷酸与反应液中的镁离子形成焦磷酸镁，不影响后续实验。如 想去除，添加 EDTA 即可消失。添加 EDTA 如果影响后续实验，也可以离心回收上清。

6. 使用试剂、容器等无 RNase 污染。

C. 37℃孵育 2 个小时

将上述反应液混合均匀，短暂离心至管底，37℃孵育 2 个小时。若转录本长度小于 100 nt，增加反应时间至 4-8 个小时。 

D. DNase I处理（可选）

反应完成后，每管加入 2 μL DNaseⅠ（RNase free），37℃孵育 15 min 以去除模板 DNA。

模板的质量与产量密切相关，实验组产量明显低于对照组可能原因有：

①实验模板中有抑制反应成分；

②实验模板本身原因。

建议：

①重新纯化模板；

②确定模板定量以及其完整性；

③延长反应时间；

④加大模板投入量；

⑤尝试其它的启动子和 RNA 聚合酶。

转录起始片段短会抑制反应，转录产物小于 100nt 时，延长反应时间至 4-8 小时或增加模板量至 2ug 可以提高 RNA 产量。

如果电泳显示产物条带大于预期大小，可能原因：

①质粒模板可能没有完全线性化；

②有义链 3’端为突出结构；

③RNA存在未完全变性的二级结构。

建议：

①检查模板是否完全线性化，如有必要，额外进行线性化；

②选择合适的限制性酶，避免产生3’突出端，或者用 Klenow Fragment 或 T4 DNA 聚合酶补齐后，再进行转录；

③使用变性胶检测RNA产物。

如果电泳显示产物条带小于预期大小，可能原因：

①模板包含类似于 T7 RNA 聚合酶的终止序列；

②模板中GC含量高。

建议：

①降低反应温度（比如，30℃），有时降低温度可以增加转录长度，但会降低产量。或者尝试不同的 RNA 聚合酶进行转录；

②若模板 GC 含量高，采用 42℃进行转录反应，或者添加 SSB 提高产量及转录长度。

电泳过程中有拖尾现象，可能原因：

①实验操作过程被 RNase 污染；

②DNA 模板被 RNase 污染。

建议：

①实验过程中使用 RNase-free 的枪头和EP管，佩戴一次性乳胶手套和口罩，所有试剂均用 RNase free H2O配制。

②重新纯化模板DNA