病原宏基因组学（mNGS）不依赖传统微生物培养，可直接高通量测序，能够快速、无偏差的检测临床样本中的全部病原，适用于急危重症和疑难感染的诊断。mNGS的整体检测流程包括核酸提取、文库构建、上机测序、生信分析与报告解读部分。

图1. 临床实验中mNGS整体工作流程[1]

T4 DNA聚合酶作为mNGS检测中的关键酶之一，发挥了至关重要的作用，不在实验中引入背景菌污染，在一定程度上利于mNGS检出率的提升。翌圣经过匠心研发，开发出高性价比的超低残留产品UCF.ME® T4 DNA Polymerase，接下来小翌将围绕该酶的作用方式、应用场景、性能展示等方面进行介绍。

什么是T4 DNA聚合酶

T4 DNA聚合酶(T4 DNA Polymerase) ，是一种模板依赖的DNA聚合酶，可以结合在有引物的单链DNA 模板上，从5' →3'方向催化DNA合成反应。T4 DNA Polymerase具有3' →5'外切酶活性，但不具有5' →3'外切酶活性，可以用于将DNA黏性末端的平滑化，也就是5'突出末端补平或3'突出末端削平。

图2. T4 DNA Polymerase作用方式

T4 DNA聚合酶的应用

T4 DNA聚合酶由于可以将DNA黏性末端平滑化的特性，常被应用在DNA建库、RNA建库、分子克隆等技术中，可应用于生物研究、肿瘤检测、感染性疾病等研究领域。其中，以DNA样本类型为例了解mNGS文库构建基本流程：

DNA建库

文库构建实质上是将片段化后的DNA两端加上通用接头序列，通过PCR扩增获取足够多能够上机测序的文库核酸分子。在DNA文库构建过程中，TA克隆连接接头建库是目前商业技术中最常用的技术手段，主要建库流程如下：

图3. DNA建库流程

DNA片段化：由于目前市场中测序仪的测序长度通常在150-500bp之间，因此需要使用机械打断或酶切打断的方法将大片段基因组DNA进行片段化。

末端修复，3'端加“A”：打断后的DNA会产生黏性末端以及平末端，而所有的黏性末端都需要转为平末端，T4 DNA聚合酶可以将这些3'突出末端切平、5'突出末端补平，最终将含黏性末端的DNA片段转变为平末端DNA。

接头连接：接头是文库中的重要组成部分，测序中常用的Illumina平台Y型接头， T4 DNA连接酶可将带有“T”黏性末端的接头和带“A”黏性末端的DNA片段连接起来形成一个完整的双链。

PCR富集：通过PCR反应获取到足够多带接头的DNA序列，上机完成对样本核酸序列的测序。

虽然mNGS具有更高的敏感性，但是mNGS检测的各个环节都可能引入内、外部来源的核酸污染。其中，减少试剂污染对结果产生的负面影响，对于识别真正的目的病原体至关重要。

翌圣生物已经建立了超低残留酶的生产工艺，UCF.ME® T4 DNA Polymerase具有超低残留、高纯度的特点，可以有效在实验中减少因背景菌导致的负面影响，提高检测结果的准确性。

性能展示

1.超低宿主残留，与进口品牌E*相当：30 U＜3 copies

图4. 使用qPCR方法检测大肠杆菌基因组残留：Yeasen-1、Yeasen-2、Yeasen-3分别为3个不同的生产批次，结果均30U<3 copies。

2.高纯度：＞95%

图5. 从左至右依次是在同批次同浓度不同体积下 (2 µL、4 µL、6 µL) UCF.ME® T4 DNA聚合酶的SDS-PAGE检测结果，其纯度＞95%。

产品订购

产品定位	产品名称	产品货号
超低残留高纯度T4 DNA聚合酶	UCF.ME® T4 DNA Polymerase (3 U/μL) T4 DNA聚合酶(3 U/μL)	14457ES
末修加A	T4 DNA Polymerase(5 U/μL) T4 DNA聚合酶(5 U/μL)	12901ES
末修加A	T4 Polynucleotide kinase(10 U/μL) T4多聚核苷酸激酶(10 U/μL)	12902ES
接头连接	Hieff® Quick T4 DNA Ligase	10301ES
rRNA去除/cDNA二链合成	RNase H 核糖核酸酶H	12906ES
rRNA去除	Recombinant DNase I (RNase-free)	10325ES
cDNA合成	Murine RNase Inhibitor(40 U/µL) 鼠源RNase抑制剂	10603ES
cDNA合成	DNA polymerase I DNA聚合酶I	12903ES
宏基因组建库DNA建库试剂盒	Hieff NGS® OnePot Ⅱ DNA Library Prep Kit for Illumina® 极速RNA 建库试剂盒	13490ES
宏基因组建库RNA建库试剂盒	Hieff NGS® Fast RNA Library Prep Kit for Illumina® 极速RNA 建库试剂盒	12304ES

参考文献

1. Han D, Li Z, Li R, Tan P, Zhang R, Li J. mNGS in clinical microbiology laboratories: on the road to maturity. Crit Rev Microbiol. 2019 Sep-Nov;45(5-6):668-685.

2. Li N, Cai Q, Miao Q, Song Z, Fang Y, Hu B. High-Throughput Metagenomics for Identification of Pathogens in the Clinical Settings. Small Methods. 2021 Jan 4;5(1):2000792.

3. Frey MW, Nossal NG, Capson TL, Benkovic SJ. Construction and characterization of a bacteriophage T4 DNA polymerase deficient in 3'-->5' exonuclease activity. Proc Natl Acad Sci USA. 1993;90:2579–2583.