文献来源：Wang H, Li L, Li Y, et al. Intravital imaging of interactions between iNKT and kupffer cells to clear free lipids during steatohepatitis. Theranostics. 2021;11(5):2149-2169. Published 2021 Jan 1. doi:10.7150/thno.51369(IF:13.3)

南京医科大学周洪老师课题组研究发现在脂肪性肝炎早期，肝脏内的iNKT细胞会与库普弗细胞动态相互作用，形成细胞簇，协同清除坏死肝细胞释放的游离脂质，从而帮助维持脂质平衡并抑制肝纤维化的发展。

一、研究背景

脂肪性肝炎（Steatohepatitis）在西方国家日益普遍，虽被视为良性疾病，但持续的炎症会发展为肝纤维化，并导致胰岛素抵抗及心血管死亡率增加。因此，深入理解肝脏免疫细胞在疾病发生发展中的功能至关重要。

iNKT 细胞：肝脏中主要的先天免疫细胞群，能调节脂质代谢和炎症。在脂肪性肝炎中，iNKT 细胞会大量募集并积累，但其具体的动态行为及在脂质代谢中的确切机制尚未被研究。

库普弗细胞（Kupffer Cells）：肝脏驻留的巨噬细胞，在脂肪性肝炎的发病机制中扮演关键角色，能产生促炎因子。然而，关于其在脂质微环境中的具体反应（如是否促进或抑制脂肪积累）存在争议。

以往的研究多依赖传统的静态实验技术，难以在活体微环境中观察免疫细胞的行为、功能变化及动态交互。因此，利用高分辨率实时成像技术（多光子显微镜）来观察这些细胞的动态过程成为了解决问题的关键。

二、研究目的

本研究旨在通过活体实时成像技术，阐明在饮食诱导的脂肪性肝炎（小鼠模型）中，iNKT 细胞与库普弗细胞的动态相互作用及其生物学效应。具体目标包括：

实时分析：观察 iNKT 细胞在脂肪性肝炎中的募集、迁移模式变化及聚集行为。

阐明交互模式：揭示 iNKT 细胞与库普弗细胞在病理微环境中的空间和时间依赖性相互作用。

解析机制：确定这些细胞簇如何处理坏死肝细胞释放的游离脂质（特别是 iNKT 细胞的吞噬功能）及相关的转录组变化。

评估疗效：通过过继转移实验，评估 iNKT 细胞在调节脂质平衡和抑制肝纤维化发展中的治疗潜力。

三、核心结论

本研究发现在脂肪性肝炎早期，肝脏内的iNKT细胞会与库普弗细胞协作，形成细胞簇。iNKT细胞会直接吞噬并清除坏死肝细胞释放的游离脂质，从而帮助维持脂质平衡并抑制肝纤维化的发展。

四、Kupffer细胞（巨噬细胞）清除实验完整步骤

（一）实验试剂、动物与模型

1.清除剂：氯膦酸盐脂质体Clodronate Liposomes, CLL（Cat#40337ES）；对照：PBS空白脂质体PBS-Lp（Cat#40338ES）。

2.实验小鼠：8-10周雄性C57BL/6野生型小鼠、Cxcr6Gfp/+ 小鼠和 Jα18-/-小鼠。

3.疾病模型：MCD饮食诱导脂肪性肝炎；对照为MCS（蛋氨酸-胆碱充足）正常饮食。

（二）清除操作时间线

1.预清除（MCD造模前24小时）

①清除组：小鼠尾静脉注射200 μL氯膦酸盐脂质体

②对照组：同步小鼠尾静脉注射200 μL PBS空白脂质体PBS-Lp

③目的：造模前完成Kupffer细胞基础耗竭，保证后续全程无功能性Kupffer细胞。

2.脂肪性肝炎造模

预清除24h后，开始饲喂MCD饮食，持续3/5/7天，诱导早期脂肪性肝炎、游离脂质释放。

3.维持清除

MCD饲喂期间，每3天尾静脉补注一次200 μL CLL/PBS-Lp，防止单核细胞来源巨噬细胞补充、维持Kupffer持续清除状态。

4.活体成像与取材检测

①活体成像：麻醉小鼠，暴露肝脏，多光子显微镜观察iNKT（GFP₊）、Kupffer（F4/80₊-Alexa647标记）聚集、互作及NileRed标记游离脂质的吞噬动态。

②终点取材：处死小鼠，分离肝组织、肝非实质细胞，做流式、免疫荧光、病理染色、qPCR，验证清除效率、脂沉积、炎症、纤维化指标。

（三）实验分组（核心4组，n≥5）

1.PBS-Lp+MCS饮食（正常对照：Kupffer完整、无肝损伤）

2.PBS-Lp+MCD饮食（模型对照：Kupffer完整、脂肪性肝炎）

3.CLL+MCS饮食（清除对照：Kupffer清除、无肝损伤）

4.CLL+MCD饮食（核心实验组：Kupffer清除+脂肪性肝炎，验证依赖关系）

（四）清除效率验证及结果

1.荧光共定位图像：旨在研究iNKT细胞与不同状态下的Kupffer细胞之间的相互作用。三维绿色表示iNKT细胞和红色表示Kupffer细胞（标记Alexa Fluor® 647抗小鼠F4/80抗体）相互作用。——CLL组清除率>90%，PBS-Lp组无显著变化，确认仅清除Kupffer、不影响iNKT等其他免疫细胞。

（五）清除实验结论

1.Kupffer完整（PBS-Lp+MCD）：iNKT与Kupffer大量聚集、形成互作簇，iNKT高效吞噬游离脂质、肝脂沉积轻、炎症弱、纤维化轻。

2.Kupffer清除（CLL+MCD）：iNKT仍可被招募到肝脏、轻度聚集，但无法与Kupffer形成稳定功能性互作簇；iNKT吞噬游离脂质能力显著下降、肝内游离脂质大量蓄积、肝细胞坏死/炎症加重、纤维化进展加快。

结论：iNKT-Kupffer协同清除游离脂质、缓解脂肪性肝炎的保护作用，严格依赖Kupffer细胞的存在与互作。

五、补充：特异性遗传清除对照

除氯膦酸盐非特异性清除，文中还使用iNKT缺陷小鼠（Jα18⁻/⁻、CD1d⁻/⁻）反向验证：iNKT缺失时，Kupffer无法聚集、脂质清除障碍——双向证明二者互作的必要性。

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