文献来源：Chen S, Zhang P, Zhu G, et al. Targeting GSDME-mediated macrophage polarization for enhanced antitumor immunity in hepatocellular carcinoma. Cell Mol Immunol. 2024;21(12):1505-1521. doi:10.1038/s41423-024-01231-0(IF:19.8) 复旦大学代智团队研究表明靶向GSDME介导的巨噬细胞极化增强肝癌抗肿瘤免疫。

  

研究背景及目的

肝细胞癌（HCC）是全球高发且致死率极高的恶性肿瘤，抗PD-1免疫治疗虽疗效显著，但大多数患者出现耐药性。肿瘤微环境中，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）多呈现免疫抑制型M2表型，可抑制CD8+T细胞毒性、促进肿瘤进展，是介导免疫检查点抑制剂耐药的关键细胞类型。Gasdermin E（GSDME）作为焦亡关键分子，既往研究多聚焦其在肿瘤细胞中诱导焦亡、激活抗肿瘤免疫的作用，但其在免疫细胞中的非焦亡功能、与肝癌免疫治疗耐药的关联尚不明确。基于此，该研究旨在揭示GSDME在肝癌肿瘤相关巨噬细胞中的表达特征与调控机制，阐明其介导抗PD-1治疗耐药的分子通路，并筛选可靶向逆转耐药的小分子化合物，为肝癌联合免疫治疗提供新策略与实验依据。

  

研究原理

该研究的核心原理围绕GSDME-PDPK1-PI3K-AKT轴调控巨噬细胞极化展开。在肝癌微环境中，巨噬细胞高表达GSDME，其非N端结构域(281-512 aa)可直接结合3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶 1(PDPK1)，促进PDPK1磷酸化并激活下游PI3K-AKT信号通路。该通路活化会驱动巨噬细胞向免疫抑制型M2表型极化，进而抑制CD8+T细胞浸润与细胞毒性，最终导致抗PD-1治疗耐药。同时，研究采用LDH释放、SYTOX green摄取等实验证实，GSDME在巨噬细胞中不触发经典焦亡，其促肿瘤作用独立于焦亡通路。基于该分子靶点，研究筛选出可特异性结合GSDME位点1的小分子化合物Eliprodil，通过阻断GSDME与PDPK1的相互作用，抑制PI3K-AKT通路活化，逆转巨噬细胞M2型极化，恢复CD8+T细胞功能，协同增强抗PD-1治疗效果。

  

研究要点

本研究要点主要分为临床发现、机制验证、靶点干预。

  

首先，发现GSDME阳性巨噬细胞可能介导肝细胞癌患者对抗PD1治疗的耐药性及不良预后。对接受抗PD-1单药治疗的肝癌患者通过对比治疗前后肿瘤大小的变化，评估PD-1治疗的疗效（图A），RNA转录组测序结果显示，PD-1治疗耐药患者的肝细胞癌组织中GSDME的表达水平显著更高。单细胞测序数据显示GSDM主要在恶性细胞和巨噬细胞中表达，且巨噬细胞中GSDME的表达水平更高。

  

构建稳定敲减GSDME的肝癌细胞系通过EdU、集落形成和CCK8实验结果显示：敲减GSDME对肝癌细胞的增殖无明显影响。裸鼠实验以及Ki67免疫组化实验也表明，敲减GSDME不会在体内抑制肝癌的生长，另外多重荧光免疫组化（mIHC）实验显示，GSDME主要在巨噬细胞中表达。此外，GSDME高表达巨噬细胞数量更多的肝细胞癌患者预后更差，且巨噬细胞中GSDME的高表达与肝细胞癌患者的肿瘤体积更大、肿瘤数量更多和甲胎蛋白（AFP）水平更高相关。

 

基于如上发现并结合GSDME在肿瘤细胞中促进细胞焦亡的经典机制，该研究在体外通过慢病毒转染构建了稳定表达小鼠GSDME（mGSDME）或空载体（NC）的B16F10和Raw264.7细胞系。给予半胱天冬酶3快速激活剂raptinal后，检测到SYTOX绿色染料摄取及乳酸脱氢酶（LDH）释放情况，发现B16F10细胞中mGSDME的过表达会导致SYTOX绿色染料摄取增加和LDH释放增多，同时还可观察到B16F10细胞膜出现明显的气泡形成（下图B-E），但在Raw细胞中未检测到此类效应（下图F-I）：扫描电镜分析显示，过表达mGSDME的B16F10细胞膜表面存在微小穿孔，而过表达mGSDME的Raw细胞则未出现此类穿孔。表明，GSDME在巨噬细胞中可能发挥与在肿瘤细胞中不同的作用，且不会显著诱导细胞焦亡。

 

 

为探究巨噬细胞中GSDME的表达对肝癌发生发展的影响，该研究在小鼠中构建了稳定的GSDME敲除骨髓来源巨噬细胞（BMDMs），用氯膦酸脂质体清除巨噬细胞后对Hep1-6荷瘤小鼠进行瘤内或静脉注射BMDMs。瘤内或静脉注射Gsdme-/- BMDMs可抑制免疫活性小鼠的肝癌增殖，增强抗PD1治疗的效果，并延长原位肝癌小鼠的生存期。对皮下肿瘤的流式细胞术分析显示，巨噬细胞中GSDME的敲除显著增加了CD8+T细胞的浸润，降低CD206+巨噬细胞（M2型）的比例，同时提高了CD4+T细胞的比例。CD4+T细胞的总数及其他免疫细胞类型的浸润情况未受到显著影响。

  

分子机制层面，通过 CoIP、PLA、蛋白截断突变等实验证实，GSDME非N端片段结合 PDPK1是激活PI3K-AKT通路的关键，PDPK1或AKT1敲低可完全抵消GSDME对巨噬细胞极化的调控作用。

药物干预层面，虚拟筛选与体外验证确认Eliprodil可特异性结合GSDME位点1，阻断其促通路活化作用；在肝癌模型中，Eliprodil均可抑制肿瘤生长，与抗PD-1联用疗效最优，且无明显器官毒性。

研究结论

GSDME是肝癌抗PD-1治疗耐药的关键标志物，其在肿瘤相关巨噬细胞中高表达与患者不良预后密切相关。GSDME在巨噬细胞中不依赖焦亡通路，而是通过非N端结构域结合PDPK1，激活PI3K-AKT通路驱动M2型极化，构建免疫抑制微环境。敲除或抑制巨噬细胞GSDME，可有效重编程肿瘤微环境，增加CD8+T细胞浸润，逆转抗PD-1耐药。小分子化合物Eliprodil可特异性靶向GSDME位点1阻断其介导的信号通路活化，联合抗PD-1治疗在多种肝癌模型中展现显著协同抗肿瘤效果，是极具潜力的肝癌免疫治疗增敏药物。该研究首次揭示GSDME在巨噬细胞中的非焦亡促癌机制，为攻克肝癌免疫治疗耐药提供了全新靶点与联合治疗策略。

小鼠巨噬细胞耗竭的文献方法和结果

方法

C57BL/6J小鼠，氯膦酸盐脂质体（40337ES）采用腹腔注射方式来清除巨噬细胞，并以空白脂质体（40338ES）作为对照，注射剂量均为200μl/只。采用流式细胞术通过F4/80与CD11b抗体检测巨噬细胞清除效率。

结果

相较注射空白脂质体的对照组，注射了氯磷酸盐脂质体的小鼠巨噬细胞的清除效率达98%。

 

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