实验材料

1. cDNA样本：通过上游反转录反应得到的cDNA。
2. 荧光定量试剂：Hieff UNICON® ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix (No/Low/High Rox)。
3. 其他试剂：RNase-free H₂O、相关基因上下游引物(储存浓度10 μM)。
4. 设备与耗材：移液器、qPCR仪、冰盒、离心机、RNase-free八连排、RNase-free离心管。

 

实验步骤

1.试剂&样本前期准备

试剂解冻和混匀：

1）从冰箱中取出：

• 从-20℃冰箱中取出含酶试剂，立即放入冰盒中（冰上操作）。
• 避免将试剂直接放在室温下解冻，以免温度波动影响酶的活性。

2）缓慢解冻：

• 让试剂在冰上自然解冻，通常需要5-10分钟。
• 如果需要快速解冻，可以将试剂握在手中轻轻摇晃，但不要过度加热。

3）轻轻颠倒混匀：

• 解冻后，将试剂管轻轻上下颠倒几次，使试剂充分混匀。
• 避免剧烈震荡或涡旋混匀，以免破坏酶的活性。

4）低速离心：

• 将试剂管短暂离心（5-10秒，1000 rpm左右），使管壁和管盖上的液体集中到管底。
• 离心后再次轻轻混匀，确保试剂均匀分布。
• 混匀后的试剂应继续放在冰上，避免长时间暴露在室温下。

Tips：混匀时尽量避免产生气泡，气泡可能会影响酶的活性或实验结果的准确性。

2.模板稀释(若需要)

稀释步骤：

1）若需追踪模板，按以下步骤稀释：

• 取1 μL 10×Dilution Buffer + 9 μL无菌超纯水 → 配制1×Dilution Buffer。
• 用1×Dilution Buffer稀释cDNA至目标浓度（建议稀释至Ct值20-30的范围内）。

2）若无需追踪模板，直接用无菌超纯水稀释cDNA或者直接使用cDNA原液。

3.荧光定量PCR反应体系配置

常见的荧光定量仪器为96孔反应，大体分为12列×8行。举例说明：

备注说明：

• 相对定量分析基因表达情况时，为排除样本和操作的影响，对数据进行归一化，需要有内参基因，例如GAPDH、β-actin等等。
• 技术重复通常建议设置3孔，为保证后续取平均值或剔除异常值。当然根据自己的需求进行调整，设置2孔重复或者4孔重复均可。
• 依据MIQE准则，NTC(阴性对照)建议设置，一方面用于污染风险判断，另一方面其也是一套实时荧光定量 PCR (qPCR) 实验设计及数据报告实践指南以及与发文共享实验信息的标准。

 

荧光定量PCR体系（大体系配制减少误差）：

1）大体系配制

组分	单孔量	大体系配制建议
Hieff UNICON® ColorGPS qPCR Master Mix	10 μL	根据孔数n，选择n+1或者n+2总数(每孔18μL)，配成一个大体系。
正向引物（10 μM）	0.4 μL
反向引物（10 μM）	0.4 μL
RNase-free H2O	7.2 μL

以上述投入2μL cDNA模板检测不同样本基因1为例：

基因1检测组分	单孔量	21孔位大体系配制建议(22孔量)
Hieff UNICON® ColorGPS qPCR Master Mix	10 μL	220 μL	396 μL
正向引物（10 μM）	0.4 μL	8.8 μL
反向引物（10 μM）	0.4 μL	8.8 μL
RNase-free H2O	7.2 μL	158.4 μL

将上述溶液依次加好后，将管盖盖严，用手轻弹管壁，使各组分充分混匀，再放入小型离心机，短暂离心1-2s，再次轻弹管壁（防止有气泡），瞬间离心（防止部分溶液沾到管壁上）并置于冰/冰板上。

备注：如使用显踪剂建议模板投入体积控制在2-5 μL，以保证显踪效果，如使用cDNA母液建议投入体积控制在2 μL(反应体系的1/10)以内防止影响扩增效果。

 

2）上样体系配置

• 按照上机仪器选取对应耗材（八联排或96孔板）。
• 在对应耗材中按照布板依次分装18μL/孔步骤1)配置的大体系Mix。
• 在每个孔中加入2 μL对应模板。

基因1检测组分	单孔量
步骤1）配置大体系Mix	18 μL
cDNA模板	2 μL

 

移液枪加样Tips(吸一排二)：

• 吸取液体：缓慢、平稳地按下按钮至第一档(不是按到底)，然后将吸头浸入液面下，然后缓慢、平稳地松开档位至原位来吸取液体。注意不要让吸头接触到容器的边缘或底部，以防止污染。
• 液体排出：将吸头对准接收容器，然后缓慢、平稳地按下按钮至第二档(按到底)以排出液体。确保所有的液体都被排出。

完成加样后，将管盖盖严，用手轻弹管壁，使各组分充分混匀，再放入小型离心机，短暂离心1-2s，再次轻弹管壁（防止有气泡），瞬间离心（防止部分溶液沾到管壁上）确保无气泡后置于洁净的96孔PCR管架。

备注：注意观察每一枪是否吸到了气泡，若出现气泡吸取则会导致实验数据出现较大偏差。

 

4.荧光定量PCR上机运行

上机前，仔细检查管子，确保正上方管盖、管身没有记号笔染料，管内无气泡、管壁无液体。

若采用常规程序，则进行以下设置：

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	2 min	1
变性	95℃	10 sec	40
退火/延伸	60℃(可根据引物TM值和目的基因的长度)	30 sec
熔解曲线阶段	仪器默认设置		1

备注：

• 不同荧光定量qPCR试剂核心的酶和Buffer组成都存在差异，对应说明书上的程序是该产品大多数情况下的最适反应条件，建议按照说明书的程序进行仪器设置，减少因用其他程序带来的数据偏差。
• 熔解曲线程序可选用仪器默认程序。

备注：以ABI Q5常规程序为例，在进行程序设置时，确保在退火/延伸阶段和熔解曲线的升温阶段打开数据信号收集开关。

若采用快速程序，需确认仪器本身是否可以快速升降温，运行快速程序。以下以ABI Q5为例：

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	30	1
变性	95℃	3 sec	40
退火/延伸	60℃(可根据引物TM值和目的基因的长度)	10 sec
熔解曲线阶段	仪器默认设置		1

 

5.结果判定

50. 观察熔解曲线峰是否单一。
50. 初步判断复孔间Ct值差距是否＜0.5，或者进一步计算复孔间CT值STD是否＜0.2。
50. 内参基因Ct值尽量在14-25之内，不要过小也不要过大。

 

6.数据分析

下机得到的Excel数据处理如下：

图示说明：

• ④：对照组校正后的数值；
• ③/④：每个小组校正后的数值比上对照组校正后的数值；
• 意图表上的数据在excel中采用了保留2位小数的形式，实际计算时不可忽略小数点后的所有数字，减少按数字的动作，活用Excel。

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