荧光定量PCR是实验室中出镜率非常高的一种技术手段。它通过在PCR体系中添加荧光基团来显示DNA产物的累积情况，从而达到对PCR过程进行实时监控的目的。并且可以通过数据分析计算出起始模板量，这就是“荧光定量”中“定量”一词的来源。
荧光定量PCR实验因为灵敏度高所以经常是差之毫厘谬以千里，所以在实验过程中，我们需要注意诸多细节，谨慎操作。小伙伴们看到这里就要着急了，我怎样才能做好qPCR实验，拿到实验结果，发表高分文章，走上人生巅峰呢？
引物设计的好坏，关乎着扩增效率的高低、产物特异性的与否。所以正确设计出引物是qPCR成功的第一步。
首先，我们知道qPCR是特殊的PCR，所以，qPCR的引物设计要满足一般PCR引物设计的原则，见下表。
除此之外，qPCR引物设计需要额外注意几点。
1. 扩增片段长度：
扩增效率随着扩增子长度减小而增大，建议扩增产物最好在80-200bp的范围，若产物小于75bp，扩增子很难与引物二聚体区分开，若产物大于300bp，则会因为酶活降低导致扩增效率降低。如果你的扩增产物因为实验需求一定要在500-600bp的话，做qPCR实验时要选用三步法扩增，不要用快速两步法扩增。
2. 区分isoform：
对于同一个基因名来说，可能会有不同的isoform。isoform指的是，对于同一个基因，它的mRNA有多种不同剪接方式，这个时候表达出来的的蛋白可能会有不同，所以小伙伴们在设计实验的时候，一定要想清楚自己要做的是哪一个isoform。
举个“栗子”：比如说一个基因有四种不同的isoform，如果大家想要检测的是四种不同剪接方式转录本之和，那么设计引物时就要针对这四个isoform的共有序列设计。如果只想检测其中一种isoform，那就要在这个isoform与其他三个isoform的不同序列位置设计引物。
3. 跨内含子设计引物：
跨越内含子设计引物可以区分并且规避基因组DNA污染。设计引物时需要让一端或两端引物跨越内含子，以人基因组来说，平均每个基因有8.8个外显子和7.8个内含子，80%的外显子长度小于200bp，少于10%的内含子长度在1100bp以上，不到0.01%的内含子长度小于20bp。（Sakharkar MK et al. Distributions of exons and introns in the human genome[J].In Silico Biol. 2004;4(4):387-93.）例如外显子长度200bp，为了兼顾扩增子长度，我们可以把上游引物设置在外显子1和外显子2的中间，下游引物设置在外显子2的位置（如下图所示）。
好啦，以上是引物设计需要注意的问题，在设计好引物之后，我们需要在NCBI上进行BLAST检验，来确保产物的特异性。
理论知识很丰富了，现在让我们实战一下吧！
第一步：选择靶基因
打开NCBI，选择“Gene”，输入想要检测的基因名称，我们以人基因“ALAD”为例。
会出现很多搜索结果，我们选择需要的种属来源，即“human”，如果你知道Gene ID（每个基因有且只有一个特定的ID，类似于人的身份证），也可以根据Gene ID来选择。这里我们选择搜索结果中的第一个。
点开之后，会出现很长的页面，耐心往下拉，找到“mRNA and Protein（s）”栏下的NM编号，不同的NM编号，代表不同的isoform。选择想要检测的那一个。
确定NM号点击后，可以看到这个isoform的一些基本信息。
例如： 
以及此基因的序列，如下图所示。此序列就是设计引物时对应的模板。
例如：
第二步：用软件设计引物
引物设计软件有很多，例如oligo7、Primer5、Clone Manager等，以及很多在线网站，例如Primerbank （https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/）、
Primer3plus（http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi） 、
NCBI 的Primer BLAST等。在手头没有安装合适的软件的时候，我们可以选择在线网站设计引物。
小翌以NCBI网站里的Primer BLAST为例讲解。
打开NCBI,在页面底端有Primer BLAST。
点击Primer BLAST后，在弹出来的界面里粘贴模板序列或者输入基因序列号。另外需要设置“上下游引物位置”和“扩增子长度”。主要的设置就是这两点了，另外还有“物种名称”、“数据库”等其他选项可以设置。
设置好之后，点击页面左下角的“get Primer”
弹出如下界面，点击“Check”
出现多对引物，选择合适的引物即可。
第三步：BLAST检验
在NCBI主页的右边找到BLAST入口。
点击后，选择“Nucleotide BLAST”。
在界面里输入引物序列，选择对应数据库。进行BLAST。
以上是对qPCR引物设计的介绍，相信小伙伴们通过小翌的介绍，对如何设计引物已经有一定的了解啦。
