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产品描述
增强型ECL化学发光检测试剂盒用于检测直接或间接标记辣根过氧化物酶（HRP）的抗体及其关联的抗原。其原理是，蛋白质或核酸在电泳后转移到印迹膜上，以一抗及HRP标记的二抗结合膜上的目的蛋白，或以HRP标记的探针直接或间接结合膜上的核酸。洗膜后用本产品配制的ECL工作液，室温孵育膜数分钟，将印迹膜用保鲜膜包被粘贴固定于X光片曝光暗盒。然后转入暗室将X光胶片压在膜上曝光数秒到数小时，显影定影后蛋白质或核酸条带可清晰显示在X光胶片上。
本试剂盒采用了独特的发光底物系统，降低曝光背景的同时引入新型的氧化剂，大大提高试剂盒的稳定性，使其在室温能稳定放置一年。除用于X光片，还可直接使用荧光CCD扫描，主要用于WB检测以及化学发光免疫检测系统。
翌圣为您提供Western Blot实验整体解决方案，相关产品选购请参考：WB实验系列产品-选购指南
产品组分
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组分编号 |
组分名称 |
产品编号/规格 |
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36222ES60（100 mL） |
36222ES76（500 mL） |
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36222-A |
A液 |
50 mL |
250 mL |
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36222-B |
B液 |
50 mL |
250 mL |
运输与保存方法
常温运输。频繁使用可置于室温保存，一年稳定；长期不用，建议置于4 ºC保存延长效期。
【注】：A液（36222-A）需避光保存！
操作方法（以X光胶片为例）
1. 执行常规电泳、转膜、HRP标记抗体或者HRP标记核酸探针孵育、洗膜。
【注】：ECL发光液是HRP的显色底物，因此检测系统最终必须基于HRP酶标记抗体或者核酸探针。
2. 最后1次洗膜的同时，新鲜配制发光工作液（推荐100-200 μL发光液/cm2膜）：分别取等体积的A液和B液，混匀备用。
【注】：取A液和B液一定要用不同的枪头；另建议立即使用工作液，室温放置数小时后仍可使用但灵敏度略有降低。
3. 用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液，勿使膜完全干燥。用移液器将工作液加到膜上，使之充分接触。室温孵育1-2 min，准备立即压片曝光。
4. 用平头镊子夹起膜，膜的下缘轻轻接触吸水纸，去除膜上多余的液体，留下少量工作液，不可让膜完全干燥。
5. 在X光胶片暗盒内表面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将印迹膜贴在保鲜膜上，将保鲜膜折起来完全包裹印迹膜，去除气泡和皱褶，可剪去边缘部多余的保鲜膜。用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖印迹膜的保鲜膜固定在暗盒内，蛋白带面向上。
6. 暗房内取一张X光胶片至于包裹的膜上，压片，曝光30 sec-2 min，显影定影冲洗。【注】：曝光时间需根据曝光强度做相应的调整。若是背景过高，可使用两张X光胶片同时压片。
其他曝光方法
如果使用CCD拍照：可以将膜放置于工作液中，开机后按照使用说明，将膜取出，进行拍照。另外，也可以根据情况，调整机器测量参数，提高信噪比。
注意事项
1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2）转膜、封闭、孵育都需要避免气泡，另外戴手套可以避免在膜上留下手印，保持膜的干净。
3）长时间曝光或蛋白过量，将加深背景并使条带强弱变化失去线性关系。曝光不足则条带模糊。
4）某些保鲜膜包裹印迹膜时可能会淬灭荧光，应选择高质量保鲜膜。
5）避免将多张膜置于同一个洗膜盒内洗膜，相互吸附或摩擦可能造成很深的背景。
6）使用肉眼可见的预染色蛋白Marker和荧光-放射自显影曝光标签可精确确定胶片上条带的位置和大小。
7）使用生物素-亲和素系统，避免使用牛奶封闭，可能会导致背景过高。
8）金属氧化物颗粒可能会造成膜上出现颗粒状斑点，避免使用带有锈迹的剪刀以及镊子，建议使用塑料的平头镊子。
9）叠氮化钠（NaN3）能抑制HRP活性，若回收HRP标记探针或者抗体应避免使用NaN3，如必需使用勿超过0.01%。
10）本品无特殊毒性，按普通化学品处理。
11) 本产品仅作科研用途!
问题与解决方案
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遇到的问题 |
原因分析 |
推荐解决方法 |
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胶片无条带显现或者信号较弱 |
转膜的效率低 |
提高转膜效率，用预染Marker判断。 |
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抗原/抗体量少或不匹配 |
增加抗原/抗体量或选择合适抗原/抗体 |
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X光胶片有问题 |
曝光后X光谱全黑（而非透明色），则表明胶片已完全曝光，使用新的X光片 |
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显影/定影液有问题 |
可预先曝光一张胶片进行判断，如有问题当换用新的显影/定影液 |
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反应系统中HRP量过多 |
稀释HRP标记物 |
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X光片背景脏 |
一抗二抗浓度太高 |
降低抗体浓度，延长封闭时间 |
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抗体未清洗干净 |
增加洗膜次数 |
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条带有空斑 |
抗原以及二抗的浓度过高 |
稀释样品重新跑胶，也可将混合好的显色液冰浴后，加到膜上即刻快速显色。 |
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带型不规则 |
转膜有气泡或甲醇（对于PVDF膜）水化不均匀 |
优化转膜条件。 |
HB181130
