Western Blot蛋白免疫印迹(WB)快速实验攻略

WB即Western Blot，蛋白质免疫印迹。是一种基于抗原抗体的特异性结合，半定量检测样品中某种蛋白的技术。作为分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种经典实验方法，WB虽看似简单，却常因各种因素做不出好看的结果图，甚至拿不到结果。今天，小翌就带领大家从头开始，一整个过一遍超详细的实验流程，保管你一学就会，结果图好看的让人敬佩！

完整的WB流程，如下图所示，包含样本制备、SDS-PAGE、转膜、抗体结合、蛋白检测5个大步骤。

翌圣为您提供Western Blot实验整体解决方案，相关产品选购请参考：WB实验系列产品-选购指南。

样品制备

01

蛋白提取（以RIPA裂解液为例）

1）融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF（Cat#20104ES），使PMSF的最终浓度为1 mM。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS（Cat# 60158ES）、生理盐水或无血清培养液洗一遍。按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。细胞充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。

悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250 μL裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必须分装成0.5-1×106个细胞/管，然后再裂解。
组织样本：按照每20 mg组织加入150-250 μL裂解液的比例加入裂解液。用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。

3）充分裂解后，10000-14000 g离心3-5 min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

【注】：RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理，或者在裂解液中加入全能核酸酶（Cat#20156ES）打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。

相关产品详情

产品货号	产品名称	规格	目录价/元
20101ES	RIPA lysis buffer (strong) RIPA裂解液（强）	100 mL	228
20115ES	RIPA Lysis Buffer (Medium) RIPA裂解液（中）	100 mL	228
20118ES	Lysis Buffer for WB/IP Assays 免疫印迹及免疫沉淀用（WB/IP）裂解液	100 mL	228

02

蛋白定量

1）配制BSA标准品体系

标准品稀释液为蛋白样品的溶解液，原则上蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但也可用0.9%的NaCl或1×PBS进行稀释，配置成梯度浓度的标准品。或者您可以选购BCA蛋白浓度测定试剂盒(即用型)（Cat#20200ES）该产品标准品已经配置好可以直接使用。

2）取25 μL标准品或待测样品加入到微孔板中。

3）每孔加入200 μL BCA工作液，振荡30 s充分混匀。盖上微孔板，37℃孵育30 min。

4）冷却到室温，在酶标仪上的540-595 nm波长范围处检测吸光度，其中562 nm波长为最佳。

5）根据BSA标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数），绘制标准曲线（X-蛋白浓度ug/mL；Y-最终的OD562 nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。

相关产品详情：

产品货号	产品名称	规格	目录价/元
20201ES	BCA Protein Quantification Kit BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）	500 T/2500 T/5000 T	288/818/1518
20200ES	BCA Protein Quantification Kit（Ready to use） BCA蛋白浓度测定试剂盒(即用型)	500 T	358

SDS-PAGE电泳

电泳凝胶可选择SDS-PAGE凝胶配置试剂盒、PAGE凝胶快速制备试剂盒、预制胶（Bis-Tris体系）三种。

以预制胶操作为例：

1）剪开包装取出预制胶，撕去胶板底端深绿色胶带，缓慢地拔出梳子，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满电泳缓冲液，外槽液体加入量要高于电泳槽高度1/3。可用移液枪或其他工具吸取电泳缓冲液轻轻吹打加样孔，去除加样孔内残留的储存缓冲液和杂质。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5×SDS-PAGE上样缓冲液（Cat#20315ES）。水浴溶解后立即室温存放。

3）按照每4 μL蛋白样品加入1 μL 5×SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热 3-5 min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）在每个样品孔中上样10-30 μg蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，推荐150 V，跑50-70 min，通常电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳结束，取出凝胶，使用起胶器(Cat#80838ES)或其他合适的工具插入到胶板两侧之间的空隙中，慢慢的上下撬动上、中、下三个不同的位置，然后在另一侧重复操作，直至胶板两侧完全打开。

7）胶板打开后，凝胶可能粘在胶板的任意一侧，将有凝胶一侧的胶板倾斜至水中，轻轻拨动凝胶，使凝胶自由掉落到装有水的器皿中，晃动清洗凝胶，然后取出进行后续转膜实验。

产品详情

产品货号	产品名称	规格	目录价/元
20350ES	三色预染蛋白质分子量标准（8-180 kDa）	250 μL/2×250 μL/10×250 μL	386/676/2766
20352ES	三色预染蛋白质分子量标准(10-245 kDa)	2×250 μL/10×250 μL	789/2996
20328ES	SDS-PAGE凝胶配置试剂盒	1 kit (30~50 gels)/ 1 kit (150~250 gels)	177/719
20324ES- 20327ES	PAGE凝胶快速制备试剂盒	浓度：8%、10%、12.5%、15%	312
36259ES-36280ES	预制胶（Bis-Tris体系）	浓度：8%、10%、12%、4-12%、4-20% 上样孔数：10孔、12孔、15孔	428

转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5 min。（如果检测小分子蛋白质，可省略该步骤，因小分子蛋白容易扩散）。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10 min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2 min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。（膜的选择：0.45 μm孔径，用于一般蛋白；0.22 μm孔径，用于分子量小于20 kD蛋白）

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用滚轮或试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液（Cat#20329ES）中300 mA, 60 min转膜处理，或使用快速转膜液（Cat#36123ES）400 mA仅需15-35 min即可完成转膜。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5 mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10 min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。注：如果没有出现染色条带，则表示转膜失败，可能需要重新转膜或重新上样电泳。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5 min。

8）脱色：将膜放到0.1M NaOH溶液漂洗5 min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用TBST清洗膜2~3次，每次5 min。

10）将膜置于25 mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时或使用快速封闭液（Cat#36122ES）处理10 min完成封闭。

11）用5 mL TBST（Cat#60145ES）洗涤三次，每次15 min。

产品详情：

产品货号	产品名称	规格	目录价/元
36125ES	0.45 μm PVDF 膜（1 卷, 30 cm x 3 m）	1 卷	1895
36126ES	0.22 μm PVDF 膜（1 卷, 30 cm x 3 m）	1 卷	1895

抗体孵育

1）将膜和一抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10 mL一抗稀释缓冲液中在4ºC下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5 mL TBST洗涤三次，每次15 min以去除残留的一抗。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10 mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5 mL TBST洗涤三次，每次15 min。

产品详情：

产品货号	产品名称	规格	目录价/元
36206ES	WB专用一抗二抗稀释液	100 mL/500 mL	147/538

蛋白检测

1）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

2）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液，勿使膜完全干燥。将膜完全浸入发光工作液（125 μL发光工作液/cm²膜）中，与发光工作液充分接触。室温孵育3 min，准备立即压片曝光。

3）用镊子夹起膜，搭在滤纸上沥干发光工作液。但勿洗去发光液。

4）在X光胶片暗盒内表面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将印迹膜贴在保鲜膜上，将保鲜膜折起来完全包裹印迹膜，去除气泡和皱褶，可剪去边缘部多余的保鲜膜。用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖印迹膜的保鲜膜固定在暗盒内，蛋白带面向上。

5）暗房内压X光胶片，分别曝光不同的时间，如数秒到数分钟。显影冲洗。（从刚开始的10 s曝光时间中可以看出适当的曝光时间。由于检测反应的动力学特征，在孵育后信号立即变得最强，但在随后的2小时内会减弱）

产品详情：

产品货号	产品名称	规格	目录价/元
36208ES	ECL化学发光超敏显色试剂盒	100 mL/500 mL	395/1655
36222ES	增强型ECL化学发光检测试剂盒	100 mL/500 mL	325/1255

WB常见问题

问题	可能原因	方案建议
背景高：	封闭不充分	更换使用新鲜的封闭液，适当延长封闭时间。
	洗涤不充分	增加洗涤次数及时间，除去非特异结合。
	一抗浓度过高	稀释抗体至合适浓度。
	样品有问题	检查蛋白样品的纯度盒质量，建议使用新鲜样品。
	膜干燥	在孵育过程中防止膜变干，保证膜充分接触反应液。
信号弱或完全缺失：	转膜不充分	检查蛋白转移的效率和时间是否正确。
	PVDF膜未激活	PVDF膜先浸泡在甲醇中激活，再转移到转膜缓冲液中。
	一抗不识别检测物种的蛋白	参考说明书，比对免疫原序列和蛋白序列以保证抗体和目的蛋白会发生反应，设置阳性对照。
	一抗和二抗不匹配	检查一抗和二抗的种属：二抗需和一抗宿主的物种相同。
	没有足够的一抗和二抗结合目标蛋白	适当增加抗体浓度，演唱4℃孵育时间（如过夜）。
	抗原量不足	每泳道蛋白上样量不低于20-30 μg，试用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照。
	组织中目的蛋白含量低	参考文献或数据库，确认靶标蛋白是否在待检组织或细胞中表达。如表达量较低，可以浓缩使信号最大或，同时增加高表达的阳性对照组，避免操作中出现问题。
出现“非特异性”条带、多带等现象：	细胞系传代次数过多，蛋白表达谱发生变化	使用未传代或传代次数较少的细胞系（不超过15代）进行样品制备。
	细胞系传代次数过多，蛋白表达谱发生变化	使用未传代或传代次数较少的细胞株，和现在的细胞株一起做平行对照试验。
	蛋白被降解	裂解液确保含有蛋白酶抑制剂，蛋白样品提取后-80℃短期保存，避免反复冻融，有条件尽量用新鲜提取的蛋白。
	蛋白本身具有多种修饰形式	查阅文献，确定目的蛋白是否存在多种修饰，如泛素化、糖基化等修饰会让蛋白的条带发生较大的偏移。
	所检测蛋白存在多种剪接体，导致分子量大小不同	查阅文献或者通过搜索数据库来确定该蛋白是否存在多种长度不同的编码mRNA。
	蛋白存在二聚体或多聚体	SDS loading buffer中现用现加β-巯基乙醇或DTT。
	样本存在外源转入蛋白	检查所用样本是否被转入外援蛋白。如有，更换细胞系样本。
	上样量过多	根据靶标表达情况，梯度上样跑胶后选择合适的上样量，通常20-30 μg即可。
	靶蛋白形成多聚体	煮样时，煮沸10分钟，使蛋白质解聚。
	一抗浓度过高	一抗浓度过高时常出现多条带，需降低抗体浓度和/或孵育时间。
	二抗浓度过高	高浓度会产生非特异性结合，需江都抗体浓度，增加二抗对照。
	检测到未经报道过的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而结构不同的蛋白	查阅文献报道，或BLAST搜寻，使用说明书推荐的细胞株或组织。
	检测到未经报道过的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而结构不同的蛋白	若确保操作没有问题，那么，您可能是发现了新蛋白！
微笑条带：	迁移过快、电泳缓冲液温度偏高、蛋白质超载或孔内运行缓冲液不足	应降低迁移速度、预冷缓冲液、减少蛋白上样量、缓冲液完全覆盖孔，确保内室缓冲液不会泄露到外室
皱眉条带：	装置不合适，可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。	可通过调整装置来避免该问题。
条带拖尾：	样品溶解不好；存在一定程度地蛋白降解；电泳液反复多次使用。	样品充分溶解混匀后上样；尽量使用新鲜样本；使用新鲜配制的电泳缓冲液。
哑铃状不均匀条带：	配置胶有问题，胶凝固后不均一；样品可能含有过多杂质。	重新配置胶，确保胶质量无问题来避免该现象出现；在样品使用前离心。
条带粘连：	可能是上样量太多，或者是制胶问题，分离胶和浓缩胶之间有间隙，样品窜孔。	可通过减少上样量和提高配胶质量来避免。
条带空泡：	转膜时膜上有气泡	确保在组装“三明治”时，移除凝胶和印迹膜间的所有气泡。
背景有不均匀的黑色斑点：	封闭液未完全溶解，使不容颗粒附着在膜上从而导致发光时候膜上形成黑点；或抗体在膜上分布不均	封闭液一定要充分溶解，封闭结束之后要用 TBST 清洗三遍再加一抗；抗体孵育时保持摇动。
条带空斑：	可能是一抗二抗浓度过高，促使底物过快消耗，导致在进行化学发光时，底物耗尽形成空斑。	降低一抗二抗浓度