Western Blot实验原理

蛋白免疫印迹（Western Blot，WB）是将蛋白质经电泳分离后转移到膜上，然后利用抗体进行检测的技术。完整的WB流程，如下图所示，包含样本制备、SDS-PAGE、转膜、抗体结合、蛋白检测等5个大步骤。

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液，读这些就够了！），混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。按照6孔板每孔加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。细胞充分裂解后应无没有明显的细胞沉淀。

悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250 μL裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成0.5-1X10⁶个细胞/管，然后再裂解。

组织样本：按照每20 mg组织加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

【注】：RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。

2. 蛋白定量

1）配制BSA标准品体系

标准品稀释液为蛋白样品的溶解液，原则上蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但也可用0.9%的NaCl或1XPBS进行稀释。BSA标准品体系配制可参考下表。

表1 BSA标准品体系配制（微孔板检测，线性范围20-2000μg/mL）*

*如用比色皿检测，每管需加100μL标准品，按3个重复计算，每个浓度至少需配制300μL。

2）各取25μL标准品和待测样品加入到微孔板中。

3）每孔加入200μL BCA工作液，振荡30s充分混匀。盖上微孔板，37℃孵育30min。

4）冷却到室温，在酶标仪上的540-595nm波长范围处检测吸光度，其中562nm波长为最佳。

5）根据BSA标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数），绘制标准曲线（X-蛋白浓度ug/mL；Y-最终的OD562nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。

3. 蛋白电泳

1）剪开包装取出预制胶，撕去胶板底端橙色胶纸，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液，外槽液面低于内槽5-10mm，双手按住梳子左右部位将其平稳缓慢（一定要慢，否则会将胶齿拔断或拔歪）拔出。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）按照每4 μL蛋白样品加入1μl 5XSDS-PAGE 蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热 3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）在每个样品孔中上样20-40µg蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，推荐使用低压100V，跑15min，之后换高压150V跑，通常电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时，需在胶和玻璃条之间，沿着玻璃条划一刀，防止发生粘连。掰开两板，将胶取出，此时蛋白会从凝胶上慢慢扩散，因此不要保存在凝胶里，要迅速进行下一步的转移操作。

4. 转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。（如果检测小分子蛋白质，可省略该步骤，因小分子蛋白容易扩散）。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。（膜的选择：0.45μm孔径，用于一般蛋白；0.2μm孔径，用于分子量小于20kD蛋白；0.1μm孔径，用于分子量小于7kD蛋白）

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。注：如果没有出现染色条带，则表示转膜失败，可能需要重新转膜或重新上样电泳。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5. 抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4°C下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液，勿使膜完全干燥。将膜完全浸入发光工作液（125μL发光工作液/cm²膜）中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。

7）用镊子夹起膜，搭在滤纸上沥干发光工作液。但勿洗去发光液。

8）在X光胶片暗盒内表面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将印迹膜贴在保鲜膜上，将保鲜膜折起来完全包裹印迹膜，去除气泡和皱褶，可剪去边缘部多余的保鲜膜。用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖印迹膜的保鲜膜固定在暗盒内，蛋白带面向上。

9）暗房内压X光胶片，分别曝光不同的时间，如数秒到数分钟。显影冲洗。（从刚开始的10s曝光时间中可以看出适当的曝光时间。由于检测反应的动力学特征，在孵育后信号立即变得最强，但在随后的2小时内会减弱）
 

常见问题

附录：Western Blot快速实验试剂准备

1. 各类缓冲液

1）电泳缓冲液：10xTris-Glycine-SDS电泳缓冲液（20319ES76），或参考配方1X：25 mM Tris, 192 mM Glycine, 0.1% SDS, pH 8.3

2）电转缓冲液：Western Blot电泳电转通用缓冲液（20329ES03），或参考Tris-Glycine缓冲液配方

3）蛋白上样缓冲液：5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液（20315ES05），或参考配方1X：0.25MTris-HCL(pH6.8), 10%(W/V)SDS, 0.5%(W/V) BPB(溴酚蓝), 50%(V/V) 甘油, 5%(W/V)β-巯基乙醇(2-ME)/DTT

4）其他缓冲液：PBS，TBST

2. 样本制备

1）细胞裂解液：RIPA（20101ES60，或20115ES60，或20114ES60）

2）蛋白酶抑制剂：PMSF（20104ES03）

3. 蛋白定量

1）蛋白定量试剂：BCA蛋白定量试剂盒（20201ES76）

4. 蛋白电泳

1）预制胶：4-20%高分辨率梯度预制胶，10孔（36231ES10）

2）蛋白marker：三色预染蛋白分子标准（10-245kDa）（20352ES76）

5. 转膜与封闭

1）膜（自备）

2）膜上蛋白检测：丽春红染色液（36221ES60）

3）膜的封闭：BSA，无IgG（36103ES25）

6. 抗体孵育

1）抗体：内参抗体、一抗、二抗（例：30101ES10，30401ES10，34101ES60）

2）检测试剂：ECL化学发光超敏显色试剂盒（36208ES60）

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