首页 / 蛋白质研究 / 产品应用详情

即用型HRP和AP底物-TMB、pNPP、BCIP/NBT显色液

基于免疫学基本原理(抗原与抗体特异性结合),衍生出一系列针对蛋白研究的相关实验,但影响免疫学实验(如Elisa、WB等)显色成功的因素有很多,除了抗原抗体反应外最关键的是实验最后一步——加入底物,酶与底物反应后通过肉眼观察或酶标仪读取 OD 值来分析样本。根据不同的酶:辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP),所作用的底物有所不同。小翌已为您准备好了几款常用的显色底物,下面一一为您介绍下:

 

HRP底物-TMB显色液

TMB,即3, 3′,5 ,5′-Tetramethylbenzidine,中文全称3,3',5,5'-四甲基联苯胺,是辣根过氧化物酶(HRP)的常用显色底物之一。在HRP的催化下,TMB被过氧化氢(H2O2)氧化生成蓝色产物。主要吸收峰在370 nm和652 nm。在加入硫酸或者磷酸终止上述反应后,产物转变为黄色,最大吸收峰为450 nm。

 

图1 .TMB显色原理

 

传统的TMB显色试剂通常以AB液形式提供(TMB和H2O2溶液分到两管,仅在使用前才可混合使用),并且容易产生沉淀,使用起来相对不方便,且容易导致操作误差。为克服以上缺点,我司采用新的TMB显色技术,将所有相关试剂全部混合配成单一溶液。具有以下优点:

即开即用:使用前无需做AB液混合的准备;检测灵敏度不低于AB液体系;

分:仅由单一溶液组成,简化了操作步骤,也降低了操作误差,结果更加稳定;

稳定性高:含有独特的稳定剂,保证溶液4℃下长期保存;

灵敏度高:相比于其他HRP酶显色底物(如ABTS和OPD)相比,检测灵敏度更高。

安全无毒TMB溶液不含有DMF或DMSO等有机溶剂,安全无毒。

 

另外,TMB溶液可分为沉淀可溶型和沉淀不可溶型,前者适用于ELISA及其他通过液体反应检测HRP的应用,后者适用于WB或其他通过沉淀反应检测HRP的应用。

 

AP底物-pNPP显色液

pNPP,即4-Nitrophenyl phosphate disodium salt,中文全称4-硝基苯磷酸二钠,是碱性磷酸酶(AP)的底物,在酶(如碱性磷酸酶,AP)和辅助物质(如缓冲液和金属离子)存在的条件下,pNPP可以被酶催化水解为对硝基苯酚(pNP),pNP是一种黄色产物,其吸收峰位于405 nm左右。pNPP常用于基于AP标记的ELISA。本产品具有本底低、稳定性高、批间差小的特点,提供了优越的信号反应体系,适用于显色时间≤20分钟的检测实验。

 

图2.pNPP显色原理

 

AP底物-BCIP/NBT显色液

5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)/硝基四氮唑蓝(NBT)是碱性磷酸酶(AP)的最佳底物组合之一。碱性磷酸酶是一种常用于酶标记实验的酶,它可以催化底物BCIP的水解和NBT的还原。在BCIP的水解过程中,产生的5-溴-4-氯-3-吲哚在碱性条件下氧化为有色产物。同时,NBT在还原条件下被还原为紫色产物。这些有色产物可以在细胞或膜上形成可见的紫色或紫褐色沉淀,用于定性或定量检测酶的存在或活性。

传统的BCIP/NBT显色试剂通常需要在使用前混合(NBT和BCIP溶液分到两管,同时反应需要添加碱性磷酸酯酶显色缓冲液),使用起来相对不方便,且容易导致操作误差。为克服以上缺点,我司采用新的BCIP/NBT显色技术,将所有相关试剂全部混合配成单一溶液。具有以下优点:

即开即用:使用前无需做AB液混合的准备;检测灵敏度不低于AB液体系;

单 组 分:仅由单一溶液组成,简化了操作步骤,也降低了操作误差,结果更加稳定;

稳定性高:含有独特的稳定剂,保证溶液4℃下长期保存。

 

选择指南

货号

36602ES

36603ES

36604ES

36605ES

36606ES

名称

单组分TMB

显色液

(ELISA,HRP显色用)

单组份TMB

显色液

WB, HRP显色用)

单组份TMB显色液(芯片,HRP显色用)

pNPP显色液

ELISA, AP显色用)

单组份BCIP/NBT显色液

WB, AP显色用)

适用

ELISA

Western blot以及

Northern blot、

Southern blot等

蛋白芯片、

微阵列芯片等

ELISA

Western blot、Northern blot、

Microarray、ELISpot 等

底物

HRP

HRP

HRP

AP

AP

检测限

6 pg/well

100 ng

20 pg

10 pg/well

30 pg

抗体稀释比

一抗:1:1000;

二抗:1:5000-1:50000

一抗:1:500;

二抗:1:2000-1:20000

一抗:1:1000;

二抗:1:5000-1:10000

一抗:1:500;

二抗:1:5000-1:20000

一抗:1:500;

二抗:1:5000-1:50000

生成物类型

沉淀可溶型

沉淀不可溶型

沉淀不可溶型

沉淀可溶型

沉淀不可溶型

 

价格优势

【注】已全部换算为100 mL体系产品价格

图3.Yeasen产品与其他品牌同级别产品价格比对

 

常见问题

Q1:背景显色太深

1)如果背景(没有样品的对照)显色太深,一方面需考虑使用适当的封闭液进行封闭,如商业化的封闭液或者商业化的和一抗相同来源的血清(5-10%)进行封闭。另一方面,直接使用经过适当亲和吸附的二抗,以减小二抗的非特异性交叉吸附。

2)可以考虑缩短显色时间,或降低二抗浓度。另外,选择适当强度的洗涤液,或延长洗涤时间也会有所帮助。

3)可考虑TMB底物本身反应过于强烈。为了避免沉淀的产生,可在终止反应后马上读数,或者进一步稀释一抗和/或HRP结合物。

 

Q2:没有显色或显色太弱

1)适当提高一抗或二抗的浓度。检测二抗效果,滴一滴稀释二抗在离心管内,检测二抗是否被正常显色。

2)可以考虑使用更加灵敏的放大检测体系,例如使用生物素检测体系。

3)可以适当延长显色时间。

4)如果上述改进不能获得预期效果,可以考虑更换效果更好的一抗或ELISA试剂盒。

 

订购信息

产品名称

货号

规格

目录价/元

单组分TMB显色液(ELISA,HRP显色用)

36602ES

100mL

285

单组份TMB显色液(WB, HRP显色用)

36603ES

100mL

285

单组份TMB显色液(芯片,HRP显色用)

36604ES

100mL

485

pNPP显色液(ELISA, AP显色用)

36605ES

100mL

285

单组份BCIP/NBT显色液(WB, AP显色用)

36606ES

100mL

285

 

相关产品

产品名称

货号

规格

目录价/元

Elisa plate,酶标板,透明,可拆卸8孔条,白色框架

83650ES03

5块/盒

75

83650ES20

5块/盒,20盒/箱

1215

 

翌圣提供全面的一抗、二抗产品,欢迎进入官网选购。https://www.yeasen.com/products/max/241

400-6111-883