基于免疫学基本原理(抗原与抗体特异性结合),衍生出一系列针对蛋白研究的相关实验,但影响免疫学实验(如Elisa、WB等)显色成功的因素有很多,除了抗原抗体反应外最关键的是实验最后一步——加入底物,酶与底物反应后通过肉眼观察或酶标仪读取 OD 值来分析样本。根据不同的酶:辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP),所作用的底物有所不同。小翌已为您准备好了几款常用的显色底物,下面一一为您介绍下:
TMB,即3, 3′,5 ,5′-Tetramethylbenzidine,中文全称3,3',5,5'-四甲基联苯胺,是辣根过氧化物酶(HRP)的常用显色底物之一。在HRP的催化下,TMB被过氧化氢(H2O2)氧化生成蓝色产物。主要吸收峰在370 nm和652 nm。在加入硫酸或者磷酸终止上述反应后,产物转变为黄色,最大吸收峰为450 nm。
图1 .TMB显色原理
传统的TMB显色试剂通常以AB液形式提供(TMB和H2O2溶液分到两管,仅在使用前才可混合使用),并且容易产生沉淀,使用起来相对不方便,且容易导致操作误差。为克服以上缺点,我司采用新的TMB显色技术,将所有相关试剂全部混合配成单一溶液。具有以下优点:
即开即用:使用前无需做AB液混合的准备;检测灵敏度不低于AB液体系;
单 组 分:仅由单一溶液组成,简化了操作步骤,也降低了操作误差,结果更加稳定;
稳定性高:含有独特的稳定剂,保证溶液4℃下长期保存;
灵敏度高:相比于其他HRP酶显色底物(如ABTS和OPD)相比,检测灵敏度更高。
安全无毒:本TMB溶液不含有DMF或DMSO等有机溶剂,安全无毒。
另外,TMB溶液可分为沉淀可溶型和沉淀不可溶型,前者适用于ELISA及其他通过液体反应检测HRP的应用,后者适用于WB或其他通过沉淀反应检测HRP的应用。
AP底物-pNPP显色液
pNPP,即4-Nitrophenyl phosphate disodium salt,中文全称4-硝基苯磷酸二钠,是碱性磷酸酶(AP)的底物,在酶(如碱性磷酸酶,AP)和辅助物质(如缓冲液和金属离子)存在的条件下,pNPP可以被酶催化水解为对硝基苯酚(pNP),pNP是一种黄色产物,其吸收峰位于405 nm左右。pNPP常用于基于AP标记的ELISA。本产品具有本底低、稳定性高、批间差小的特点,提供了优越的信号反应体系,适用于显色时间≤20分钟的检测实验。
图2.pNPP显色原理
AP底物-BCIP/NBT显色液
5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)/硝基四氮唑蓝(NBT)是碱性磷酸酶(AP)的最佳底物组合之一。碱性磷酸酶是一种常用于酶标记实验的酶,它可以催化底物BCIP的水解和NBT的还原。在BCIP的水解过程中,产生的5-溴-4-氯-3-吲哚在碱性条件下氧化为有色产物。同时,NBT在还原条件下被还原为紫色产物。这些有色产物可以在细胞或膜上形成可见的紫色或紫褐色沉淀,用于定性或定量检测酶的存在或活性。
传统的BCIP/NBT显色试剂通常需要在使用前混合(NBT和BCIP溶液分到两管,同时反应需要添加碱性磷酸酯酶显色缓冲液),使用起来相对不方便,且容易导致操作误差。为克服以上缺点,我司采用新的BCIP/NBT显色技术,将所有相关试剂全部混合配成单一溶液。具有以下优点:
即开即用:使用前无需做AB液混合的准备;检测灵敏度不低于AB液体系;
单 组 分:仅由单一溶液组成,简化了操作步骤,也降低了操作误差,结果更加稳定;
稳定性高:含有独特的稳定剂,保证溶液4℃下长期保存。
选择指南
货号 |
|||||
名称 |
单组分TMB 显色液 (ELISA,HRP显色用) |
单组份TMB 显色液 (WB, HRP显色用) |
单组份TMB显色液(芯片,HRP显色用) |
pNPP显色液 (ELISA, AP显色用) |
单组份BCIP/NBT显色液 (WB, AP显色用) |
适用 |
ELISA |
Western blot以及 Northern blot、 Southern blot等 |
蛋白芯片、 微阵列芯片等 |
ELISA |
Western blot、Northern blot、 Microarray、ELISpot 等 |
底物 |
HRP |
HRP |
HRP |
AP |
AP |
检测限 |
6 pg/well |
100 ng |
20 pg |
10 pg/well |
30 pg |
抗体稀释比 |
一抗:1:1000; 二抗:1:5000-1:50000 |
一抗:1:500; 二抗:1:2000-1:20000 |
一抗:1:1000; 二抗:1:5000-1:10000 |
一抗:1:500; 二抗:1:5000-1:20000 |
一抗:1:500; 二抗:1:5000-1:50000 |
生成物类型 |
沉淀可溶型 |
沉淀不可溶型 |
沉淀不可溶型 |
沉淀可溶型 |
沉淀不可溶型 |
价格优势
【注】已全部换算为100 mL体系产品价格
图3.Yeasen产品与其他品牌同级别产品价格比对
常见问题
Q1:背景显色太深
1)如果背景(没有样品的对照)显色太深,一方面需考虑使用适当的封闭液进行封闭,如商业化的封闭液或者商业化的和一抗相同来源的血清(5-10%)进行封闭。另一方面,直接使用经过适当亲和吸附的二抗,以减小二抗的非特异性交叉吸附。
2)可以考虑缩短显色时间,或降低二抗浓度。另外,选择适当强度的洗涤液,或延长洗涤时间也会有所帮助。
3)可考虑TMB底物本身反应过于强烈。为了避免沉淀的产生,可在终止反应后马上读数,或者进一步稀释一抗和/或HRP结合物。
Q2:没有显色或显色太弱
1)适当提高一抗或二抗的浓度。检测二抗效果,滴一滴稀释二抗在离心管内,检测二抗是否被正常显色。
2)可以考虑使用更加灵敏的放大检测体系,例如使用生物素检测体系。
3)可以适当延长显色时间。
4)如果上述改进不能获得预期效果,可以考虑更换效果更好的一抗或ELISA试剂盒。
订购信息
产品名称 |
货号 |
规格 |
目录价/元 |
单组分TMB显色液(ELISA,HRP显色用) |
100mL |
285 |
|
单组份TMB显色液(WB, HRP显色用) |
100mL |
285 |
|
单组份TMB显色液(芯片,HRP显色用) |
100mL |
485 |
|
pNPP显色液(ELISA, AP显色用) |
100mL |
285 |
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单组份BCIP/NBT显色液(WB, AP显色用) |
100mL |
285 |
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货号 |
规格 |
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5块/盒 |
75 |
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