CelCulSF^TM Hybridoma Cell Culture Medium（Serum-free）培养基是无血清培养基，无血清无蛋白，支持杂交瘤细胞高密度悬浮培养，高效表达抗体以及大规模培养。

 

运输与保存方法

冰袋运输。2～8℃，避光保存，有效期1年。

 

使用方法

一、标准参数

参数	设定值
50mL TPP 管	培养体积： 10-20 mL
125~1000mL 摇瓶	培养体积： 摇瓶总体积的 20~30%
摇床转速	TPP：转速 220Rpm,  摇瓶 110-130 Rpm
摇床振幅,	50mm
培养基	CelCulSFTM Hybridoma Cell Culture Medium（Serum-free）
接种密度	0.5×106 cells/mL
培养温度	37℃
CO2%	5～8%
相对湿度	80%RH

二、培养基的适应

通常，在原用培养基中生长的杂交瘤细胞可直接离心换液为本培养基。特殊情况下，可尝试转移到由50%原用培养基和50% CelCulSF^TM Hybridoma Cell Culture Medium组成的新培养基中进行适应性生长。

1. 细胞传代当天，取0.5mL细胞悬液，用细胞计数仪分析活细胞密度（×10⁶细胞/mL）和细胞活率（%）。将原用培养基中生长的细胞移入新培养基*（50% CelCulSF^TM Hybridoma Cell Culture Medium（Serum-free） + 50%原用培养基），接种密度为0.5×10⁶/mL，传代后按照规定的环境条件培养细胞。

2. 细胞培养至48±3小时后，建议按此方法进行至少3次细胞适应性传代。当细胞活率高于90%时转入100% CelCulSF^TM Hybridoma Cell Culture Medium培养基培养。

三、细胞传代和扩增

1. 37℃水浴中预热CelCulSF^TM Hybridoma Cell Culture Medium培养基。

2. 使用75%酒精清洁/消毒生物安全柜。

3. 使用75%酒精喷洒培养基瓶，并置于生物安全柜。

4. 从培养箱中取出摇瓶（或TPP管），喷洒75%酒精并置于生物安全柜。

5. 接种密度为0.5×10⁶ viable cells/mL。培养48±3小时后，取0.5mL细胞悬液，用细胞计数仪分析活细胞密度（×10⁶细胞/mL）和活细胞（%）。

6. 传代前，如果Hybridoma 细胞密度低于2.0 E6 cells/mL ，或细胞活率低于90%，需要170g - 190g（大约800 rpm-1000 rpm）离心5分钟处理细胞。轻轻弃上清，使用100%新鲜培养基按0.5 ×10⁶/mL重悬细胞，并将细胞接种至新摇瓶（或TPP管），传代后按照规定的环境条件培养细胞。

7. 如果传代前Hybridoma 细胞密度高于2～3 E6 cells/mL 且活细胞率高于90%，则将适量细胞悬液转移到新摇瓶（或TPP管）中，并用新鲜培养基直接调整最终培养体积进行细胞传代，然后在规定的环境条件下培养细胞。

如果传代比（传代后的种子密度：传代前的细胞密度）大于1:4，细胞需要离心并重新悬浮在100%新鲜培养基中。

四、细胞冻存

1. 细胞冷冻前，将含新鲜异丙醇的程序降温盒、冻存管等所需材料置于4℃冰箱中，预冷至少24小时后冷冻保存，或在-20℃下放置2小时~4小时后冷冻保存。

2. 根据冻存细胞的数量、冻存体积和冻存密度（建议冻存密度为25-35×10⁶ /mL/支），计算所需的细胞量，并移入离心管中，以800rpm-1000rpm（即170g-190g）离心5min。

3. 去除剩余上清液，拍打离心管底部使细胞均匀分散，加入细胞冷冻液，轻轻吹打细胞，形成均匀的细胞悬液。

4 用一次性无菌移液管将1mL细胞冻悬液移入预冷冻存管中，置于冰上保存；

5. 离心管中的细胞悬液在分装过程中需要反复混合。分装完成后，将冻存管转移至预冷的程序降温盒中，在-80℃冰箱中至少保存24小时；

6. 转移至液氮罐中继续保存。

五、细胞复苏

1. Day 0时复苏细胞

2. 使用75%酒精清洁/消毒生物安全柜。

3. 27℃水浴中预热CelCulSF^TM Hybridoma Cell Culture Medium（Serum-free）；

4. 使用75%酒精喷洒培养基瓶，并置于生物安全柜；

5. 从液氮罐中取出冻存管，并置于干冰上；

6. 复苏1支细胞，并在37℃水浴中，轻轻晃动冻存管，解冻约1-2分钟；

7. 用75%酒精喷洒冻存管外壁；

8. 用无菌移液管将冻存管中的细胞轻轻移到含有10mL预热培养基（CelCulSF^TM Hybridoma Cell Culture Medium）的离心管中。如有必要，使用预热的培养基（CelCulSF^TM Hybridoma Cell Culture Medium）冲洗冻存管中的细胞；

9. 170g-190g（约800rpm-1000rpm）离心5分钟，丢弃上清液并将细胞重悬于10mL新鲜预热培养基（CelCulSF^TM Hybridoma Cell Culture Medium）中。

10. 取0.5mL细胞悬液，用细胞计数仪分析活细胞密度（×10⁶/mL）和细胞活率（%）。

11. 然后使用预热培养基（CelCulSF^TM Hybridoma Cell Culture Medium）将细胞密度调节至0.5×10⁶cells/mL，转移至摇瓶（或TPP）中并将细胞置于规定的环境条件下培养细胞。

12. 48±3 小时后，传代、扩大培养细胞。

注：如果细胞活率＜80%，需要170g-190g（大约800rpm~1000rpm）离心5分钟处理细胞。弃上清，使用100%新鲜培养基按0.5 ×10⁶/mL重悬细胞，置于规定的环境条件下培养细胞。

六、杂交瘤单抗生产

1. 细胞在CelCulSF^TM Hybridoma Cell Culture Medium 中培养；

2. 按0.5×10⁶cells/mL接种，72±3 小时后，取 0.5mL 细胞悬液，用细胞计数仪分析活细胞密度（×10⁶/mL）和细胞活率（%）；

3. 用相同体积的预热 CelCulSF^TM Hybridoma Cell Culture Medium 培养基稀释培养物（培养物体积：待添加的CelCulSF^TM Hybridoma Cell Culture Medium培养基体积=1:1）；

4. 根据实际生产工艺，进行测试。

 

注意事项

1.细胞应及时传代。如果细胞密度很高，会导致细胞状态下降，死亡细胞增多，细胞碎片增多，细胞聚集；

2. 液体细胞培养基不宜长时间光照或热照，应避光保存在2～8℃。

HB230113