本研究整合单细胞转录组（scRNA-seq）、两种空间转录组（scStereo-seq、MERFISH）、基因条件敲除小鼠、体外细胞共培养/迁移实验、分子生化验证多技术体系

（一）人源样本测序

1.样本收集

采集GW6–23人胚胎/胎儿脑膜组织，脑膜单细胞悬液制备：

①将脑膜组织剪碎，置于含5mg/mL胶原酶II型（40508ES）、30U/mLDNaseI（10608ES）的高糖DMEM培养基（41401ES）37℃摇床孵育消化15–30min，每10min观察一次消化程度。

②消化完成后用移液管反复吹打混匀悬液，300g离心弃上清；

③加入红细胞裂解液（40401ES）裂解红细胞，随后400g离心5min；

④沉淀细胞重悬后经40μm细胞筛（84701ES）过滤，滤液留待后续实验。

2.主要实验流程与结果

①利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）对GW8-GW23的16例人类胚胎脑膜组织进行测序，质控筛选118,696个高质量细胞，Seurat、Harmony校正批次效应，UMAP降维分群，基于经典标记注释7大类细胞（硬脑膜成纤维细胞、蛛网膜成纤维细胞、软脑膜成纤维细胞、免疫细胞、壁细胞、内皮细胞、红细胞）。

②利用scStereo-seq技术GW6–16人头部冷冻切片空间测序，Tangram算法将单细胞注释映射至空间，区分硬脑膜区DZ、柔脑膜区LZ，可视化各类细胞空间分布与比例变化，结合Monocle3技术拟时序分析成纤维细胞、巨噬细胞发育轨迹，完成所有细胞类型的空间定位与时序动态分析，绘制出全球首个人类胚胎脑膜单细胞时空发育图谱。

④利用CellChat预测细胞间配体-受体通讯网络，如CXCL12-CXCR4、CCL2-ACKR1、VEGFA。

⑤利用MERFISH技术更高分辨率原位空间图谱，精准定位层特异性标记、趋化因子、受体、脂质/转运相关基因的原位表达，证实：软脑膜最先在GW6形成，蛛网膜、硬脑膜后续逐步分化；软脑膜成纤维细胞通过CXCL12，在LZ区域原位招募巨噬细胞，解释了巨噬细胞的空间分布偏好、TREM2⁺IFH巨噬细胞与皮层CR细胞直接接触，其分泌的CCL2原位作用于CR细胞的ACKR1受体等。

（二）体内/体外基因功能验证

人类单细胞/空间组学发现fibro-pia高表达CXCL12；IFH/AH脑膜巨噬细胞表达CXCR4；脑膜巨噬细胞富集在LZ；IFHMMs高表达TREM2，并且靠近CR细胞。

小鼠体内验证1：构建Cxcl12cKO(Col1a2)小鼠，敲除脑膜成纤维细胞Cxcl12。E15.5检测发现LZ中IBA1+脑膜巨噬细胞减少，说明CXCL12对巨噬细胞招募/定位是必要的。

体外验证1：Transwell中，下室原代人脑膜成纤维细胞能吸引上室人M2巨噬细胞迁移；加入CXCL12蛋白可作为阳性趋化信号；敲低成纤维细胞CXCL12后，趋化作用减弱。说明CXCL12是脑膜成纤维细胞趋化巨噬细胞的重要分子。

小鼠体内验证2：构建Trem2cKO(Cx3cr1)和Trem2icKO(Mrc1-ER)小鼠，敲除髓系细胞或巨噬细胞相关Trem2。E15.5发现Reelin+CR细胞减少，CR细胞连续性下降，说明TREM2+脑膜巨噬细胞影响CR细胞发育。

机制筛选：分选E15.5小鼠脑膜CD206+巨噬细胞做bulk RNA-seq，发现Trem2KO后Ccl2和Nfya下调；qPCR、免疫荧光和CSF ELISA进一步验证CCL2下降。

体外机制验证2：RAW264.7诱导小鼠M2巨噬细胞，做Trem2/Nfya干预、HA-NfyaChIP和CCL2ELISA。结果显示NFYA结合Ccl2启动子-1kb区域；Trem2/Nfya缺失降低CCL2分泌；Nfya过表达可救回Trem2KD导致的CCL2下降。