大鼠原代皮层神经元和海马神经元提取与培养实验方案
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2026-06-30
大鼠原代皮层与海马神经元体外培养是神经发育、突触可塑性、神经退行性疾病机制研究及药物筛选的经典体外模型，是神经生物学研究的核心技术手段，而实验动物与原代神经元类型的科学提取与培养，是保障实验数据精准可靠的关键前提。
表1 大小鼠生理差异及应用场景
小鼠原代海马神经元提取与培养试验方案详见官网：小鼠原代海马神经元提取与培养实验方案
大鼠、小鼠胚胎原代皮层/海马神经元均能体外造模，它们是体外机制、药物初筛的标准细胞模型，其中阿尔茨海默病（AD）、帕金森（PD）、额颞叶痴呆、亨廷顿病等神经退行病变，核心损伤脑区就是海马（记忆、Aβ/tau沉积重灾区）、大脑皮层（高级认知神经元大量丢失）。
表2 皮层/海马神经元选择指南
组分：5.36 mM KCl（726332ES）；0.44 mM KH2PO4（726335ES）；137 mM NaCl（730341ES）；4.16 mM NaHCO3（730324ES）；0.34 mM Na2HPO4·2H2O；5 mM glucose（54927ES）；1 mM pyruvic acid（55814ES）；10 mM HEPES（60117ES）；0.001% phenol red（60526ES）
组分：10 mg胰蛋白酶粉末（40101ES）；①中配制好的5 mL HBSS缓冲液
制备：按照以上组分浓度现用现配，最后使用0.20 μm醋酸纤维素滤膜过滤除菌
组分：10 mL FBS（40132ES）；①中配制好的5 mL HBSS缓冲液
制备：将原装FBS瓶置于预热至56°C的水浴中孵育30分钟。热灭活后，可将FBS分装并保存于-20°C备用。按照以上组分配比配制溶液，配制好的10%FBS溶液可于4°C保存至少1个月。
组分：9.50 g/L Minimum Essential Medium Eagle（MEM）；0.6%glucose（54927ES）；1 mM pyruvic acid（55814ES）；3.64 g/L NaHCO₃（730324ES）
配制：按照以上组分浓度配制培养基并调节pH至7.2，0.20 μm醋酸纤维素滤膜进行过滤除菌，于4°C保存至少2个月。
组分：500 mL神经元细胞基础培养基（41410ES）；1× SM1添加剂；0.5 mM glutamine（60757ES）；25 μM glutamate（53667ES）；0.12 mg/mL gentamycin（60214ES）
配制：按照以上组分浓度配制培养基，配制完成后可于4°C保存至少1–2个月。
①从一只妊娠Wistar大鼠中提取E18胚胎（培养海马神经元建议使用E18胚胎，培养脑皮层神经元建议使用E17胚胎）[2-5]。
②将胚胎转移到装有150 mL预冷的含有1 mM丙酮酸（55814ES）和10 mM HEPES（60117ES）的HBSS溶液（60148ES）的100 mm培养皿（84003ES）中。
③用剪刀剪下胚胎头部，取出大脑（如图1所示）。分离大脑半球，并用镊子切除小脑以及其他非关键部位（如图2所示）。在解剖显微镜下，需使用弯形和直形镊子小心切除脑膜（如视频1所示）。
图1.不同放大倍数下观察到的E18大鼠胚胎脑组织
图2.E18大鼠胚胎脑组织中的大脑皮层，海马结构仍被包裹在其中
在大脑皮层表面可观察到脑膜
视频1.大鼠海马体解剖初步操作流程
④在显微镜下解剖并分离海马组织，并将其转移至一个装有5–7 mL含有1 mM丙酮酸（55814ES）和10 mM HEPES（60117ES）的HBSS溶液（60148ES）的60 mm培养皿（84002ES）中（最终结果如图3所示）。
注：因为细胞产量较低，故建议收集来自同一妊娠大鼠的所有胚胎的海马组织。如需制备大脑皮层神经元，则需分离出两侧大脑皮层。
图3.解剖得到的大脑皮层（左侧）和分离出的海马组织（右侧）
⑤将装有海马组织或大脑皮层组织的培养皿转移至超净工作台进行无菌操作。
注：建议使用10 mL玻璃移液管转移组织，该类型移液管管口较宽，可减少组织的机械损伤。
⑥将所有完整的海马组织或大脑皮层组织转移至15 mL离心管（83505ES）中，并用加入6 mL含有1 mM丙酮酸（55814ES）和10 mM HEPES（60117ES）的HBSS溶液（60148ES）。
注：
a.对于大脑皮层神经元的制备，需要用5–8 mLHBSS溶液（60148ES）清洗组织3次。
b.在清洗过程中，请让组织依靠重力自然沉降。
c.第二次清洗后体系的最终体积应与步骤⑥中所述一致。
d.每个15 mL离心管中建议使用4个脑半球用于制备大脑皮层神经元培养。
⑦向含有海马组织的培养体系中加入1.5 mL胰蛋白酶溶液（见配制溶液部分），并在37°C条件下孵育15min（对于大脑皮层神经元，该消化过程应缩短至10min）。孵育结束时，组织应已沉降至管底。
注：该步骤可使用水浴锅进行孵育。
⑧待组织自然沉降后，小心吸弃上清液。
⑨向沉降的海马组织中加入8 mL预先预热至37°C的10%FBS溶液（见配制溶液部分），并轻柔混匀。
⑩待组织再次沉降后，弃去上清液，并用10 mL预先预热至37°C的HBSS对海马组织进行冲洗，以去除10% FBS溶液。
⑪弃去上清液，并加入5 mL预先预热至37°C的神经元培养基（见配方部分）。
对于大脑皮层神经元培养，应将步骤⑩–⑫替换为：用冰冷HBSS清洗组织5次（每次6–9 mL），并在最后一次清洗时将体系体积调整至约4 mL HBSS。
注意：该体积经验证可使最终细胞浓度达到约3–5×106/mL。
⑫使用电动吸液器（84711ES），对海马组织悬液进行反复吹打以完成组织解离。
注意：组织充分解离后，悬液会变得浑浊（见图4）。海马神经元制备中，机械吹打应在补充神经元培养基中进行，而大脑皮层神经元制备则应在HBSS中进行。
提示：5 mL玻璃移液管（84503ES）的尖端应尽量靠近15 mL离心管(83505ES)底部，仅保留很窄的间隙以便液体通过。上下吹打时，培养基因细胞释放而逐渐变浑浊。
由于该步骤对细胞具有一定损伤性，吹打次数不应超过10次。
图4. 大脑皮层组织解离后的细胞悬液（右）。左侧离心管中为尚未解离的大脑皮层组织。海马组织细胞解离后也可获得类似结果（图中未显示）
⑬收集细胞悬液，并通过70 μm细胞过滤筛（84702ES）过滤至无菌的50 mL锥形离心管（83507ES）中。
注意：该步骤可将悬浮状态的单细胞与未完全解离的组织小团块分离开来，未解离的组织碎块会被截留在滤网上。
⑭为了进行细胞计数，按等体积混合以下溶液：HBSS、细胞悬液、台盼蓝（40207ES），每种溶液取50 μL即可满足计数需求。
⑮取10 μL步骤⑭中制备的细胞悬液加入血细胞计数板（84107ES）中。
使用配备10×物镜的倒置相差显微镜进行观察，计数位于四个角区域中的细胞数（每个计数区域面积为0.01 cm²，体积为0.0001 cm³）。
注意：每毫升悬液中的细胞数可按以下公式计算：每毫升细胞数=平均每个计数格中的细胞数×3（步骤⑭中的稀释倍数）×104其中：平均每个计数格中的细胞数=四个角大方格内细胞数的平均值；
3为步骤⑭中HBSS、细胞悬液和台盼蓝（40207ES）按1:1:1混合产生的稀释倍数；
104为血细胞计数板的换算系数。
例如：若四个计数格的平均细胞数为120个，则：
细胞浓度=120×3×104=3.6×106 cells/mL
即细胞悬液浓度为3.6×10⁶个细胞/mL。
⑯将细胞按适当密度接种于0.1 mg/mL聚-D-赖氨酸（60714ES）包被的多孔培养板中。
a.培养板包被步骤：向培养孔中加入足量的聚-D-赖氨酸工作液，使其完全覆盖孔底，于37°C孵育2小时（推荐在湿润培养箱中4°C或室温过夜包被）。包被结束后，用足量无菌蒸馏水清洗每个培养孔2次，每次均需覆盖孔底；将培养板置于超净工作台内自然晾干备用。
b.盖玻片包被前预备步骤：将盖玻片置于硝酸中，在密闭玻璃容器内持续振荡浸泡过夜（推荐使用尺寸约11×9×7 cm、壁厚0.5 cm的玻璃容器）；小心移除硝酸后，使用塑料移液管加入大量蒸馏水冲洗盖玻片，共清洗5次，每次20–30分钟；使用无水乙醇清洗盖玻片5分钟；
将盖玻片置于密闭玻璃容器中，于160°C烘干1小时；将盖玻片放置于玻璃培养皿中，在超净工作台内接受紫外线照射约30分钟进行灭菌。
c.盖玻片包被：将处理好的盖玻片转移至相应的多孔培养板中，随后按照培养板包被步骤所述方法进行聚-D-赖氨酸包被。
注：对于尺寸为11×9×7 cm的玻璃容器通常使用50 mL蒸馏水（60170ES）或无水乙醇进行清洗处理。，且该尺寸一次最多清洗100片盖玻片。若放入过多盖玻片，可能会相互粘连；用于培养板包被的聚-D-赖氨酸溶液，在连续两天使用的情况下可回收再利用一次。
⑰建议海马神经元的接种密度为9.0×104cells/cm²，大脑皮层神经元的接种密度为9.28×104cells/cm²。
接种时，海马神经元可直接使用含25 μM谷氨酸（54015ES）的补充神经元培养基（见配方部分）进行稀释和接种，而大脑皮层神经元则需接种于神经元接种培养基中（见配方部分）。在37°C、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养2–3小时后，对于大脑皮层神经元，应将接种培养基更换为不含谷氨酸的新鲜补充神经元培养基。
⑱神经元细胞培养基换液与维护：
海马神经元：每周换液1次，每次更换培养基体积的1/3。
大脑皮层神经元：每周换液2次，每次更换培养基体积的1/4。
培养至第3天时，更换1/3培养基，加入新鲜培养基（不含谷氨酸），并补充30 μM 氟尿苷（54614ES），使培养体系中的最终浓度达到10 μM（储备液浓度为10 mM），以抑制胶质细胞增殖。
注意：该步骤必须使用不含谷氨酸的补充神经元培养基，后续所有换液操作均应使用不含谷氨酸和5-FDU的补充神经元培养基。
细胞培养结果参考图5–图8。
图5.培养1天（1 DIV，1 Day In Vitro）的海马神经元
注：DIV（Day In Vitro）表示细胞在体外培养的天数，1DIV即神经元接种后培养1天。
图6.培养15天（15 DIV）的海马神经元
图7.培养1天（1 DIV）的大脑皮层神经元
图8.培养15天（15 DIV）的大脑皮层神经元
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产品分类 |
产品货号 |
产品名称 |
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细胞类 |
Trypsin 1:250 (powder) 胰蛋白酶1:250（粉末） |
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Neuronal-Basal Medium（no L-Glutamine）神经元细胞基础培养基（不含L-谷氨酰胺） |
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Fetal Bovine Serum Gold Pro 胎牛血清（特级） |
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0.4% Trypan Blue Solution 台盼蓝染色液（0.4%） |
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生化试剂 |
1X Hank's 平衡盐溶液（HBSS）不含钙、镁离子和酚红 |
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Distilled Water 蒸馏水 |
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HEPES Free Acid (1 M) Buffer Solution, Cell Culture Grade HEPES溶液（1 M），细胞培养级 |
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Poly-D-Lysine Solution 多聚-D-赖氨酸溶液（0.1 mg/mL） |
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L-Alanyl-L-Glutamine L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（等同于GlutaMAX添加剂） |
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HEPES Free Acid (1 M) Buffer Solution, Cell Culture Grade HEPES溶液（1 M），细胞培养级 |
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Phenol Red, ACS Grade 酚红 |
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小分子化合物 |
Isoflurane 异氟烷 |
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Potassium chloride, for cell culture 氯化钾,用于细胞培养 |
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Potassium dihydrogen phosphate, for cell culture 磷酸二氢钾,用于细胞培养 |
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Sodium chloride, for cell culture 氯化钠,用于细胞培养 |
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Sodium bicarbonate, for cell culture 碳酸氢钠, 用于细胞培养 |
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Dextrose (D-glucose)，D-无水葡萄糖，细胞培养级 |
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pyruvic acid，丙酮酸 |
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Anhydrous sodium dihydrogen phosphate, for cell culture 无水磷酸二氢钠, 用于细胞培养 |
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Floxuridine 氟尿苷 |
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L-Glutamic acid monosodium salt L-谷氨酸单钠盐 |
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Pyruvic acid 丙酮酸 |
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耗材类 |
细胞过滤筛，70 μm，独立包装，灭菌 |
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60 mm细胞培养皿（TC处理） |
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100 mm细胞培养皿（TC处理） |
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15 mL离心管灭菌袋装 |
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50mL离心管灭菌袋装 |
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翌圣e-HC电动大容量移液器，0.1-100 mL |
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5 mL移液管，灭菌，独立纸塑包装 |
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细胞计数板/血球计数板，玻璃 |
4.大鼠皮层神经元和海马神经元细胞应用
①神经毒性研究[7]
预处理：预添加脑源性神经营养因子（BDNF，60 ng/mL）（92129ES）诱导大鼠培养皮层神经元中的TrkB酪氨酸磷酸化，处理10mins-24h；
毒性处理：用100 μM-谷氨酸(710424ES)处理10mins后使用培养基正常培养细胞24h后发现细胞存活率降低,而60 ng/mL BDNF（92129ES）预处理24h存活神经元数量显著回升
TrkB酪氨酸磷酸化检测：利用免疫印迹法检测用BDNF处理皮层神经元以诱导TrkB磷酸化反应随时间变化强度
毒性评估：使用台盼蓝（40207ES）检测细胞存活率
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分类 |
产品货号 |
产品名称 |
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细胞类 |
Neuronal-Basal Medium（no L-Glutamine）神经元细胞基础培养基（不含L-谷氨酰胺） |
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NSC-27 supplement, serum free, 50X 无血清 NSC-27 添加剂，等同于B-27 |
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PBS (1×) 细胞培养级 |
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Penicillin-Streptomycin (100×), Suitable for Cell culture 细胞培养用青霉素-链霉素（双抗） |
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Cell Counting Kit (CCK-8) CCK-8试剂盒 |
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MTT Cell Proliferation Assay Kit MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 |
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0.4% Trypan Blue Solution 台盼蓝染色液（0.4%） |
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细胞因子 |
92129ES |
HiActi® Recombinant Human/Mouse/Rat BDNF Protein 重组人/小鼠/大鼠 脑源性神经营养因子 |
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小分子化合物 |
DL-Glutamic acid DL-谷氨酸 |
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β-Amyloid (1-42), (rat/mouse) |
②神经退行性相关研究[8]
造模方法：
a.体外自然衰老海马神经元模型：不使用氧化应激、药物诱导，依靠长期体外持续培养（＞18 DIV）模拟体内老年大鼠海马神经元特征
b.Aβ1-42寡聚体（Aβo）AD毒性模型（阿尔茨海默病毒性造模）:向大鼠海马神经元培养基中添加1 μM Aβo，持续孵育48h
c.LPS诱导TLR4介导神经炎症损伤模型：向海马神经元培养基中添加1 μg/mL LPS，持续孵育48h；
d.衰老+Aβo+LPS联合损伤模型（模拟老年 AD 神经炎症交互病理）：＞18 DIV海马神经元细胞加入1 μM Aβo，孵育48 h后不换液，直接加入终浓度1 μg/mL LPS，继续共孵育 48 h
检测方法：
a.Annexin V免疫荧光凋亡检测:药物处理48 h 后Annexin V染色(40311ES)，荧光显微镜统计凋亡神经元比例，评估细胞死亡。
b.TLR4免疫荧光定量:TLR4(768951ES)、βIII微管蛋白(766767ES)（神经元标志物）共染，ImageJ测定荧光光密度，量化神经元TLR4表达水平
c.Fura2/AM钙荧光成像:钙离子荧光探针标记神经元，记录LPS刺激前后胞内钙离子浓度变化（F340/F380荧光比值），观察钙应答差异；同步区分神经元与胶质细胞钙信号。
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分类 |
产品货号 |
产品名称 |
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细胞类 |
Neuronal-Basal Medium（no L-Glutamine）神经元细胞基础培养基（不含L-谷氨酰胺） |
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NSC-27 supplement, serum free, 50X 无血清 NSC-27 添加剂，等同于B-27 |
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Fetal Bovine Serum Gold Pro 胎牛血清（特级） |
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PBS (1×) 细胞培养级 |
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Penicillin-Streptomycin (100×), Suitable for Cell culture 细胞培养用青霉素-链霉素（双抗） |
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Fura-2, AM, Cell Permeant 细胞膜可渗透钙离子荧光探针 |
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Annexin V-FITC/7-AAD 细胞凋亡检测试剂盒 |
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抗体类 |
Toll-Like Receptor 2 Rabbit mAb |
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beta III Tubulin Rabbit mAb |
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小分子化合物 |
LPS,from Escherichia coli O111:B4 脂多糖来源于大肠杆菌O111:B4 |
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β-Amyloid (1-42), (rat/mouse) |
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疾病分类 |
产品名称 |
作用位置 |
作用原理 |
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多发性硬化症 |
中枢神经系统（体感皮层、脊髓、杏仁核、小脑等），神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞 |
①外周来源的TNF-α诱导体感皮层突触后树突棘和突触前轴突终末周转增加，破坏突触结构；②神经元自身产生的TNF-α增加皮层神经元钙信号频率、自发神经元活动，引发皮层过度兴奋和焦虑样行为；③结合TNFR1促进突触功能障碍，结合TNFR2则有相反作用；④早期通过稳态缩放发挥代偿作用，后期引发兴奋性毒性和神经元死亡。 |
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中枢神经系统，神经元、轴突 |
通过调节F-肌动蛋白细胞骨架，保护轴突并促进轴突生长，间接保护突触，维持突触功能。 |
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中枢神经系统，皮层神经元 |
与TNF-α协同作用，诱导局灶性皮层损伤，使损伤邻近的皮层神经元沉默，引发突触功能障碍。 |
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阿尔茨海默病 |
中枢神经系统（海马体、皮层），小胶质细胞、神经元 |
①IFN-I刺激小胶质细胞介导的突触丢失，引发记忆障碍；②IFN-γ由T细胞产生，诱导小胶质细胞介导的突触清除，导致学习能力受损；阻断IFN-γ受体或敲除小胶质细胞的IFNAR可减少突触丢失、小胶质细胞活化和学习障碍。 |
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中枢神经系统（海马体、皮层），神经元、小胶质细胞 |
在AD病理出现前，即可降低抑制性GABA能神经传递，同时增加兴奋性谷氨酸能神经传递，打破突触兴奋-抑制平衡，引发突触功能障碍，最终导致神经元过度兴奋和损伤。 |
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中枢神经系统（脑膜、脑实质），谷氨酸能神经元、小胶质细胞 |
由脑膜γδ17 T细胞产生，通过结合IL-17Ra，抑制谷氨酸能神经传递、短期记忆和长时程增强（LTP），引发突触功能障碍和认知衰退；在雌性AD转基因小鼠中，γδ17 T细胞在脑和脑膜中积累，是突触功能障碍和认知下降的核心诱因。 |
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神经发育障碍 |
胚胎期中枢神经系统、成年后体感皮层/海马体，谷氨酸能神经元 |
母体T辅助17细胞产生的IL-17A，通过胎盘作用于胚胎期神经元，引发子代皮层结构异常、社交能力缺陷等ASD/SZ样行为；成年后，IL-17A通过结合体感皮层谷氨酸能神经元的IL-17Ra，调控社交和焦虑样行为，作用效果因释放时机、脑区、浓度不同而有差异。 |
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胚胎期中枢神经系统（海马体），神经元 |
母体来源的IL-6通过胎盘进入胚胎，结合神经元上的IL-6R-β/gp130受体，启动突触形成相关的转录程序，导致胚胎海马体谷氨酸能突触的结构和功能异常升高，成年后子代出现脑回路过度连接、ASD/SZ样行为缺陷。 |
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胚胎期中枢神经系统、成年后腹侧海马体，神经元、小胶质细胞 |
母体来源的TNF-α可影响子宫内脑回路发育，导致子代先天恐惧行为异常；成年后，应激状态下小胶质细胞释放的TNF-α升高，诱导海马体AMPAR电流增加，维持应激引发的突触变化和焦虑行为。 |
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癫痫 |
中枢神经系统（海马体、皮层），小胶质细胞、神经元 |
①小胶质细胞中TNF-α升高，增加癫痫易感性，可引发致死性癫痫发作；血脑屏障可渗透的TNF-α抑制剂可减轻癫痫发作；②直接注射入海马体时，TNF-α可抑制癫痫发作，其双向作用由结合的受体决定：TNFR1促进癫痫发作，TNFR2抑制癫痫发作；③ 可通过调控电压门控钠通道（Nav1.3、Nav1.8）转录，改变神经元兴奋性，影响癫痫发作。 |
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中枢神经系统（海马体），谷氨酸能神经元 |
结合IL-1R1受体，与NMDAR的NR2B亚基结合，促进NR2B磷酸化，增加NMDAR介导的Ca²⁺内流，增强神经元兴奋性，引发海马体神经元过度兴奋，促进癫痫发作；阻断IL-1R1可抑制神经元过度兴奋，减轻癫痫发作。 |
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中枢神经系统（海马体），神经元 |
与IL-1β作用相反，IL-18缺乏会增强基础神经传递、增加突触数量，加剧癫痫发作；IL-18可通过调控突触功能，维持神经元兴奋-抑制平衡，抑制癫痫发作。 |
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可卡因和吗啡成瘾 |
中枢神经系统（纹状体、外侧缰核），神经元、小胶质细胞 |
①可卡因反复给药后，纹状体小胶质细胞释放TNF-α，驱动突触后膜AMPAR内吞，降低突触强度，限制行为敏化的发展，对可卡因成瘾产生适应性保护作用；②吗啡戒断期，外侧缰核内TNF-α显著升高，伴随谷氨酸能神经传递降低，调控突触可塑性和吗啡相关的行为适应，介导戒断引发的厌恶情绪。 |
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神经性疼痛 |
中枢神经系统（脊髓、海马体），小胶质细胞、神经元 |
小胶质细胞产生的TNF-α，调控脊髓和海马体神经元回路的突触传递，介导疼痛相关的突触可塑性变化，是神经性疼痛的核心调控因子；细胞内蛋白酶CASP6可通过促进小胶质细胞释放TNF-α，直接调控脊髓突触传递和炎症性疼痛。 |
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类别 |
解决方案 |
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类别 |
解决方案 |
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培养用细胞因子 |
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类器官培养案例 |
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类别 |
解决方案 |
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多能干细胞 胚胎干细胞 诱导多能干细胞 |
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专能干细胞 神经干细胞 造血干细胞 间充质干细胞 |
IL-3/SCF/FLT3L：赋能HSPC体外高效扩增的核心驱动体系 |
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培养用细胞因子 |
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类别 |
解决方案 |
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先天性免疫细胞 吞噬细胞 树突状细胞 自然杀伤细胞 嗜酸/碱性粒细胞 |
小鼠骨髓来源的树突状细胞（BMDC）培养方法及细胞因子的选择 |
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适应性免疫细胞 T细胞 B细胞 |
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参考文献
[1] Ivan L. Salazar, Miranda Mele, Margarida V. Caldeira, et al. Preparation of Primary Cultures of Embryonic Rat Hippocampal and Cerebrocortical Neurons[J].bioprotocol,2017,7(18).
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