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产品简介
Hieff NGS® In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina® V2 是针对Illumina®高通量测序平台研发的用于CUT&Tag实验的文库构建试剂盒，适用于100-100,000个细胞起始量的样本建库。CUT&Tag是研究蛋白与DNA互作的技术，相较于传统的ChIP-seq、CUT&RUN，该技术具有文库构建时长更短（仅需7小时）、操作更简单、对起始样本要求更低、抗体投入量更少、文库产量更高等优点。经过细胞捕获、一抗孵育、二抗孵育、转座酶孵育、转座酶激活、掺入DNA标准品、细胞裂解、磁珠回收gDNA、文库扩增和磁珠分选等步骤，靶蛋白结合的DNA片段最终转化为适用于Illumina®平台测序的文库。
本试剂盒包含两个独立模块：BOX-I和BOX-II。BOX-I包含结合细胞的ConA Beads、提取DNA 的DNA Extract Beads以及文库纯化的DNA Selection Beads，BOX-II包含细胞透化剂、抗体结合buffer、转座酶结合buffer、蛋白酶K以及后续文库扩增所需的所有试剂。此外，本试剂盒已在不同种类细胞（如293T、K562、CHO、ESC细胞等）中进行了验证，均具有良好的建库效率和建库产量。本试剂盒提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库的稳定性和重复性。
产品信息
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产品名称 |
产品编号 |
规格 |
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Hieff NGS® In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina® V2 CUT&Tag试剂盒（pA/G-Tn5版） |
12597ES04 |
4 T |
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12597ES12 |
12 T |
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12597ES48 |
48 T |
组分信息
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组分编号 |
组分名称 |
12597ES04 |
12597ES12 |
12597ES48 |
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BOX-I |
12597-A |
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ConA Beads |
40 μL |
120 μL |
480 μL |
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12597-B |
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DNA Extract Beads |
280 μL |
840 μL |
3.36 mL |
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12597-C |
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DNA Selection Beads |
400 μL |
1.2 mL |
4.8 mL |
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BOX-II |
12597-D |
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10 × Binding Buffer |
120 μL |
360 μL |
1.44 mL |
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12597-E |
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10 × Wash Buffer |
600 μL |
1.8 mL |
7.2 mL |
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12597-F |
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5% Digitonin |
45 μL |
135 μL |
540 μL |
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12597-G |
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50 × PB Buffer |
6 μL |
18 μL |
72 μL |
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12597-H |
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10 × Dig-300 Buffer |
400 μL |
1.2 mL |
4.8 mL |
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12597-I |
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pA/G-Transposome Mix |
8 μL |
24 μL |
96 μL |
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12597-J |
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100 × Activating Buffer |
4 μL |
12 μL |
48 μL |
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12597-K |
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15 × Terminate Solution |
20 μL |
60 μL |
240 μL |
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12597-L |
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30 × Proteinase K |
10 μL |
30 μL |
120 μL |
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12597-M |
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DNA Spike-in Mix (5 ng/μL) |
4 μL |
12 μL |
48 μL |
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12597-N |
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2×HiFi Amplification Mix |
100 μL |
300 μL |
1.2 mL |
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12597-O |
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Goat Anti-Rabbit lgG(H+L)* |
2 μL |
6 μL |
24 μL |
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12597-P |
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N5 (N501)** |
4 μL |
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-- |
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12597-Q |
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N7 (N701)** |
4 μL |
-- |
-- |
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注意：*本试剂盒中包含的二抗为山羊抗兔二抗，适用于使用一抗来源于兔源的研究，若需要一抗来源于鼠源的研究，需客户自行准备抗鼠二抗（Yeasen cat#34851ES）或其他等效产品。
**测序时 Index 序列 填写时，测序平台为NovaSeq 6000 v1.0 reagents, MiSeq, HiSeq 2000/2500，则N501-CTCTCTAT，N701-TAAGGCGA。测序平台为NovaSeq 6000 v1.5 reagents，MiniSeq, NextSeq,HiSeq 3000/4000，则N501-ATAGAGAG，N701-TAAGGCGA。
***本试剂盒在实验前需自备蛋白酶抑制剂Cocktail（Yeasen Cat#20123ES）或其他等效产品。
储存条件
BOX-I：2-8℃保存，BOX-II：-25~-15℃保存，有效期1年。
注意事项
- 关于操作
1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。
3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
4. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离、配备文库构建专用移液器等设备以及定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度。
5. 操作细胞应尽量轻柔以保持细胞活性。
6. 本产品仅用作科研用途！
- 应用范围
本试剂盒适用于细胞投入量为100-100,000个的CUT&Tag研究。原则上，所有真核生物的新鲜样本或冻存样本都能适用于本试剂盒，但不同的样本类型需要进行不同的样本前处理（如组织样本的单细胞悬液制备、植物样本或者真菌样本的原生质体制备或细胞核悬液制备）后才能按照本实验操作流程进行实验。
- ConA beads操作注意事项
1. 使用前将磁珠平衡至室温，请勿将磁珠置于0℃以下存放。
2. ConA beads与细胞结合后，应避免剧烈震荡或用力吹打磁珠-细胞复合物使细胞应力损伤导致磁珠与细胞分离。
3. 在处理磁珠溶液时应尽量避免高转速离心或长时间置于磁力架上，人为造成磁珠凝集。
4. 避免磁珠长时间暴露在空气中使得磁珠干裂或者磁珠-细胞复合物损伤（不超过3 min）。
5. 孵育过程中出现部分磁珠沾壁/聚集是正常现象，只有保证磁珠-细胞复合物处于溶液浸润的范围内，不会影响后续的实验结果。
6. 本产品仅用作科研用途!
- 关于DNA Extract Beads及DNA Selection Beads操作注意事项
1. DNA Extract Beads用于转座反应后的基因组DNA 提取，DNA Selection Beads在文库纯化过程中使用，切勿弄错。
2. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。
3. 请勿将磁珠置于0℃以下存放。
4. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
5. 转移上清时，请勿吸取到磁珠，即使枪头吸取微量磁珠都将影响后续文库质量。
6. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。
7. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3 min足以让磁珠充分干燥。
8. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4°C可保存2天，-20°C可保存1个月。
- 关于试剂
1. 不同的Buffer试剂应注意保存条件，避免失效。
2. Digitonin有细胞毒性，且容易降解。在溶液配制过程中请做好个人防护。加入Digitonin的溶液应现配现用，在4℃放置不超过2天。
- 文库结构
Index 2 (i5)
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACIIIIIIIITCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-NNNNNN-CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACIIIIIIIIATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’
Index 1 (i7)
IIIIIIII: Index 2 (i5), 8 bases；IIIIIIII: Index 1 (i7), 8 bases；-NNNNNN-: 插入序列。
- 关于抗体选择
- CUT&Tag实验中使用的一抗，建议使用ChIP级别或者CUT&Tag、CUT&RUN实验验证过的抗体，若无法达到抗体要求级别，可以使用IF级别抗体进行实验尝试。
- 实验中建议设置阳性对照和阴性对照组，阳性对照推荐使用样本中表达丰度较高的组蛋白，阴性对照推荐使用不加入一抗但正常加入二抗和转座子，用于判断整个实验过程中是否存在异常，加入非特异性IgG的阴性对照不是必须的，在测序分析中并未提供有价值的信息，可以根据实验需要，自行选择是否添加。
- CUT&Tag实验中使用的二抗，建议根据一抗种属以及Protein A/G的亲和能力选择无任何标记或修饰（HRP、FITC等）的二抗，二抗种属来源以及与Protein A/G的亲和能力进行选择，可以参照以下表格：
【注】：+++++代表亲和能力非常强，+++代表亲和能力中等，+代表亲合能力很弱，-代表没有亲合能力。
二抗推荐：Guinea Pig anti-Rabbit IgG (Heavy & Light Chain) antibody（antibodies-online Cat#ABIN101961）
驴抗兔IgG H&L （Abcam #ab6701）
山羊抗兔IgG H&L（Abcam #ab6702）
山羊抗兔IgG H&L（Yeasen #34850ES）
Rabbit anti-Mouse IgG (Heavy & Light Chain) Antibody（antibodies-online Cat#ABIN101785）
山羊抗小鼠IgG H&L（Abcam #ab6708）
山羊抗小鼠IgG H&L（Yeasen #34851ES）
- 关于文库扩增
1. 本试剂盒中的文库扩增组分由本公司高保真DNA聚合酶所组成，大大增强了扩增的均一性，即使是低拷贝的基因，也能进行无偏好性地扩增。
2. 推荐使用本公司的Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (Yeasen Cat#12416)模块进行文库扩增，该模块提供了384种不同组合的双端index文库制备引物，最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。
3. 对于PCR循环数，原则上在满足上机的前提下，尽量降低扩增循环数。特别是少量细胞和低丰度蛋白，循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，将导致文库偏好性增加、重复度增加、大片段增多、嵌合产物增加、扩增突变累积等多种不良后果。表2以293T细胞为例，使用中高丰度表达的组蛋白(如H3K4me3、 H3K27me3)进行CUT&Tag实验，细胞投入量、扩增循环数与文库产量之间的关系如下表所示：
表2细胞投入量与扩增循环数推荐表（H3K4me3/H3K27me3）*
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细胞投入量 |
PCR循环数 |
文库产量 |
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100,000 |
11-13 |
10-50 ng/μL |
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10,000 |
12-14 |
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1,000 |
15-17 |
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100 |
18-20 |
【注】：*由于不同靶蛋白的表达量、DNA结合能力差异较大。实验中需根据建库起始细胞量、蛋白类型、细胞类型和样本处理情况适当调整扩增循环数。推荐在PCR之前使用qPCR的方法对转座酶插入的片段进行初步定量判断再决定循环数。
- 本试剂盒适用的细胞投入量为100-100,000个，受细胞类型、抗体选择以及目的蛋白表达丰度的影响，实验中可以兼容的最低细胞投入量并不是固定的，早期实验时建议投入10,000-100,000个细胞，待获得较理想的结果后，再探索低起始细胞量，细胞量低于10 K时，由于细胞容易损失，实验成功率会降低，建议增加重复组数量。
- 关于DNA标准品
DNA Spike-in Mix（5 ng/μL）是来源于大肠杆菌 Lambda DNA的三段序列，长度分别为230 bp、250 bp和300 bp，摩尔浓度比约为1：3：10(见图1)。标准品主要用于在不同处理条件下或者不同细胞状态下测序数据Normalization和定量分析。本试剂盒中提供的DNA Spike-in浓度为5 ng/μL，推荐添加量为5 pg/10万（每10 w 细胞建议用TE buffer稀释1000倍加1 μL），根据实际细胞投入量将DNA Spike-in梯度稀释后添加，也可根据靶蛋白的结合DNA能力和丰度自行调整。标准品序列：
Spike-in-1: GTTCCACTCCTGAAGTGTCAAGTACATCGCAAAGTCTCCGCAA
TTACACGCAAGAAAAAACCGCCATCAGGCGGCTTGGTGTTCTTTCAGTTCTT
CAATTCGAATATTGGTTACGTCTGCATGTGCTATCTGCGCCCATATCATCCAGT
GGTCGTAGCAGTCGTTGATGTTCTCCGCTTCGATAACTCTGTTGAATGGCTCT 
CCATTCCATTCTCCTGTGACTCGGAAGT
Spike-in-2: AGTCGGTGTGAATCCCATCAGCGTTACCGTTTCGCGGTGCTTC
TTCAGTACGCTACGGCAAATGTCATCGACGTTTTTATCCGGAAACTGCTGTCT 
GGCTTTTTTTGATTTCAGAATTAGCCTGACGGGCAATGCTGCGAAGGGCGTTT
TCCTGCTGAGGTGTCATTGAACAAGTCCCATGTCGGCAAGCATAAGCACACA
GAATATGAAGCCCGCTGCCAGAAAAATGCATTCCGTGGTTGTCATACCT
Spike-in-3: CCTTACTGGAATCGATGGTGTCTCCGGTGTGAAAGAACACCAACAGGGGTGTTACCACTACCGCAGGAAAAGGAGGACGTGTGGCGAGACAGCGACGAAGTATCACCGACATAATCTGCGAAAACTGCAAATACCTTCCAACGAAACGCACCAGAAATAAACCCAAGCCAATCCCAAAAGAATCTGACGTAAAAACCTTCAACTACACGGCTCACCTGTGGGATATCCGGTGGCTAAGACGTCGTGCGAGGAAAACAAGGTGATTGACCAAAATCGAAGTTACGAACAAGAAAGCGTCGA
