“打破真菌的‘铜墙铁壁’，只需一把精准的‘分子钥匙’。”

                                                   ——从酵母转化到原生质体制备，溶壁酶是真菌研究的必备利器。

图1 溶壁酶三维结构表面模型（图源网络，侵删）

一、背景介绍：真菌细胞壁——科研路上的“硬骨头”

在生命科学研究的广阔天地中，真菌（如酵母、霉菌、食用菌等）扮演着极其重要的角色。它们是基因工程的常用宿主、药物生产的关键工厂，也是研究真核细胞生物学的经典模型。

然而，想要深入探究真菌内部的遗传物质、蛋白质或代谢产物，研究人员首先必须面对一道天然的屏障——细胞壁。

真菌细胞壁主要由β-1,3-葡聚糖、几丁质、甘露聚糖及少量蛋白质交联而成，结构致密且坚韧。传统的物理破壁方法（如玻璃珠振荡、液氮研磨、超声破碎）虽然有效，但往往存在以下痛点：

1. 产热严重：易导致内部蛋白变性或核酸降解；
2. 操作繁琐：难以实现高通量处理；
3. 回收率低：剧烈机械力可能破坏细胞器完整性；
4. 重复性差：不同批次间破壁效率波动大。

有没有一种温和、高效且特异性强的方法，能像“手术刀”一样精准切除细胞壁，同时保持原生质体的完整与活性？

答案就是——溶壁酶（Lyticase / Lywallzyme）。

二、技术应用：溶壁酶如何“温柔”地瓦解细胞壁？

1. 作用原理：酶解的协同效应

溶壁酶并非单一酶，而是一种复合水解酶制剂。其主要来源包括藤黄节杆菌（Arthrobacter luteus）或长梗木霉（Trichoderma longibrachiatum）发酵纯化所得。

其核心成分包含：

β-1,3-葡聚糖酶：主攻细胞壁骨架，切断β-1,3-糖苷键；

几丁质酶：分解几丁质微纤丝；

蛋白酶/甘露聚糖酶：辅助降解连接蛋白和侧链多糖。

这些酶协同作用，特异性地水解细胞壁的多糖网络，使细胞壁逐渐变薄直至完全消失，释放出具有生物活性的原生质体（Protoplast）。由于酶解过程在温和的缓冲液中进行（通常30℃左右），能最大程度保护细胞膜及内部细胞器的完整性。

图2 溶壁酶催化机制示意图（图源网络，侵删）

2. 核心应用场景

1）原生质体制备与融合：用于真菌遗传育种、体细胞杂交，获得高产菌株。

2）酵母转化实验：去除细胞壁后，外源DNA更容易进入细胞，显著提升转化效率（尤其是酵母人工染色体YAC的构建）。

3）高纯度核酸/蛋白提取：相比机械法，酶解法获得的裂解液杂质更少，特别适合对剪切力敏感的基因组DNA或大分子蛋白复合物提取。

4）细胞壁组分分析：研究细胞壁合成机制及抗药性机理。

5）工业应用：食用菌孢子制备、酵母抽提物生产等。

• 优势总结：特异性强、条件温和、原生质体再生率高、批次稳定性好。

三、常见实验步骤（实验方案）

以下以翌圣生物（Yeasen）溶壁酶为例，介绍酵母原生质体制备的标准操作流程：

实验前准备：

• 菌种：对数生长期的酵母细胞（OD600 ≈ 0.8–1.0）
• 试剂：Yeasen 溶壁酶、山梨醇（渗透压稳定剂）、DTT（二硫苏糖醇）、YPD培养基、SCE缓冲液
• 设备：恒温摇床、离心机、显微镜

 

操作步骤：

1、菌体预处理

收集对数期酵母细胞，用无菌水洗涤2次。重悬于含10-20 mM DTT的SCE缓冲液中，30℃孵育15-30分钟。

目的：DTT可打断细胞壁蛋白的二硫键，软化细胞壁，提高酶解效率。

2、酶解反应

1）离心收集菌体，用含1.2 M 山梨醇的STC缓冲液（渗透压稳定剂，防止原生质体破裂）洗涤2次。

2）将菌体重悬于STC缓冲液中，加入溶壁酶。

推荐用量：终浓度通常为 0.15–0.5 U/μL（或每10^8个细胞加入100–200 U酶），具体视菌种而定。

3）置于30℃恒温摇床（低速，50-80 rpm）孵育。

时间监控：每隔10分钟取样镜检，当90%以上细胞由椭圆形变为球形（原生质体）时，即停止反应（通常需30-60分钟）。

3. 原生质体收集与洗涤

1）轻柔离心（1000 × g, 5 min, 4℃），弃上清。

2）用预冷的含1.2 M山梨醇的STC缓冲液轻柔洗涤2次，去除残留酶液。

3）最后重悬于适量STC缓冲液中，即可用于转化、融合或下游分析。

4. 质量检测

显微镜观察：正常原生质体应呈规则球形，无碎片。

再生率测试：涂布于低渗再生培养基，计算菌落形成率，评估原生质体活性。

• 关键注意事项：

1. 渗透压稳定剂必不可少：去除细胞壁后，细胞极易吸水涨破，全程必须在高渗环境（如山梨醇、蔗糖）中操作。
2. 避免剧烈震荡：原生质体非常脆弱，移液和离心动作需轻柔。
3. 现配现用：酶液建议临用前配制，或分装保存于-20℃，避免反复冻融。 

四、总结：解锁真菌研究的“金钥匙”

溶壁酶以其高效、特异、温和的特性，已成为真菌分子生物学研究中不可或缺的工具。它不仅简化了原生质体制备的流程，更大幅提升了酵母转化、基因编辑及组学分析的成功率。

对于致力于真菌基因功能研究、工业菌种改良或天然产物开发的科研人员而言，选择一款高活性、低杂酶的溶壁酶产品，意味着更稳定的实验结果和更高的科研产出。

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