将宫颈肿瘤组织放入含Pen-Strep（60162ES）+ Amphotericin B（60238ES）的PBS（60158ES）中，用眼科剪去除坏死组织、正常宫颈组织及黏膜（通过病理切片确认肿瘤边界）。

用PBS清洗3次，将组织剪成1 mm³的小块（宫颈组织较致密，剪碎至0.5-1 mm³更易消化）。

剪碎的组织块放入含90% FBS（40130ES）和10% DMSO（60313ES）的冻存液，梯度降温（4℃ 30 min → -20℃ 1h → -80℃过夜→液氮保存）。

复苏时37℃水浴快速解冻，PBS清洗2次，后续步骤同新鲜样本。

将组织小块转移至15 mL离心管（83506ES），加入5 mL组织消化液（41423ES）。

37℃水浴摇床（100 rpm）消化45-60 min，期间每10 min轻轻吹打1次（宫颈组织致密，避免剧烈振荡）。

加入1 mL热灭活FBS终止消化，PBS稀释至10 mL，800 rpm离心5 min，弃上清。

沉淀用5 mL PBS重悬，通过70 μm细胞筛（84702ES）过滤（去除未消化的组织块），收集滤液。

800 rpm离心5 min，弃上清，用宫颈癌类器官培养基重悬，Trypan Blue（40724ES）染色计数（活细胞活力需≥70%，否则影响类器官形成率）。

基质胶（Ceturegel）（40192ES）从-80℃转移至4℃过夜解冻，接触Ceturegel的耗材（离心管、枪头）预冷至4℃。

取1×10⁵-3×10⁵活细胞，800 rpm离心5 min，弃上清，用200 μL预冷的Ceturegel重悬（轻柔吹打，避免气泡）。

快速将Ceturegel-细胞悬液滴加到12孔板（84012ES）孔底（每孔200 μL，形成液滴），避免接触孔壁。

37℃、5% CO₂培养箱孵育20-30 min，使Ceturegel凝固。

沿孔壁缓慢加入1 mL预温的培养基（避免冲散Ceturegel），放入培养箱培养。

换液频率：每2天换1次培养基（宫颈类器官代谢活跃，需及时补充营养）。

传代时机：类器官直径达到150-200 μm（培养5-7天），或密度达孔底70%时传代（宫颈癌类器官增殖较快，避免过度拥挤导致坏死）。

传代步骤：

吸弃培养基，加入500 μL预冷PBS清洗1次，吸弃。

加入300 μL Cebrary^® Cell recovery solution for Organoid（41421ES），4℃孵育15 min，轻轻吹打溶解Ceturegel。

加入700 μL培养基，800 rpm离心5 min，弃上清。

沉淀用Ceturegel重悬，按1:3-1:4比例接种到新12孔板，重复包埋步骤。

长期保存：传代后类器官用冻存液（90% FBS + 10% DMSO）冻存，-80℃过夜后转移至液氮。