冰盒提前放置15 mL离心管（83506ES）一支，提前加入3 mL Addf+++缓冲液（DMEM/F12（41420ES）+ Glutamax（60701ES）+ Hepes（715388ES）+ Penicillin/Streptomycin（60162ES）+ Primocin（60281ES），将新鲜肿瘤组织放于其中。

将离心管中肿瘤组织及Addf+++加入到6 cm培养皿（84002ES）中，用刀片将肿瘤组织切碎，留一部分放于冻存管（84105ES）中冻存备用。

继续用刀片将肿瘤组织切碎片至3 mm³大小，加入1 mL Addf+++吹打清洗。

用枪头小心吸去培养皿中残余的Addf+++。

将组织小心转移至12孔板（84012ES）中，每孔加入1 mL提前稀释的1.5 mg/mL胶原酶（40507ES），37度培养箱消化1-2个小时,期间每10分钟用枪头吹打一次，促进消化。

显微镜下观察，确保组织完全消化。

将消化后的细胞全部转移到15 mL离心管中，用Addf+++冲洗12孔板，确保所有消化细胞被完全转移至15 mL离心管中，加入适量红细胞裂解液（40401ES）。

1500 rpm离心5分钟，若见红色沉淀，则室温下加1 mL红细胞裂解液，计时4分钟，加入1 mL Addf+++吹打，1000 rpm离心5分钟。

枪头吸去上清，加入1 mL Addf+++轻轻吹打沉淀，1500 rpm离心5分钟，弃上清。

基质胶（Ceturegel）（40192ES）与培养基按25 μL：15 μL/孔混合。

将细胞与Ceturegel混合，均匀铺在提前预热的24孔板（84013ES）中，37度30分钟凝固，24孔板每孔加入400 μL培养基，3-4天换液一次，2周传代一次。

冻存前一天将细胞换液。

标记冻存管（84105ES）。

取对数生长期的细胞，去除培养液。

预热的PBS洗1-2次。

去除PBS，胰酶消化细胞，待细胞变圆、呈漂浮状态时加完全培养液终止消化，吹打使其成为均匀的细胞悬液。

将细胞收集于15 mL离心管中，离心800 rpm，5 min。

去除上清，加含有保护剂的预冷冻存液，轻轻吹打使细胞悬浮。

将细胞悬液分装于冻存管中，封口并标记。

将冻存管放置于冻存盒（84608ES）内，置于-80℃；类器官能在-80℃稳定保存一个月。

取出要复苏的细胞，迅速将冻存管投入到已经37℃预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，约1-2 min，使管中的冰冻细胞迅速融化到2/3状态（不完全融化的目的是低温减少DMSO对细胞的毒性）。

取出冻存管，用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

从预先准备的培养基本中吸取1 mL加入冻存管中，使剩余1/3完全融化，转移细胞到剩余的培养基中。

用托盘天平平衡后，放入离心机中800 rpm离心5 min。

尽量吸除上清液后，加入1 mL培养液，吹打细胞使其成细胞悬液。

将细胞悬液全部移入已有培养液的24孔板中。

置于37度，5% CO₂培养箱培养。