配制AdDF+++：向Advanced DMEM/F12（41420ES）中添加1%青/链霉素（60162ES）、1%谷氨酰胺（60314ES）和1% HEPES缓冲液（60117ES），该溶液简称为AdDF+++。

配制消化液：向15 mL离心管（83506ES）中加入10 mL AdDF+++，10 mL Y27632（52604ES），200-400 mL胶原酶I（40507ES），50-100 mL透明质酸酶（20426ES），50-100 mL DNase I（10325ES）。

肿瘤组织处理：先在装有PBS（60158ES）的培养皿中清洗组织，将组织块修剪成5 mm x 5 mm x 5 mm大小，然后在另一个装有PBS的培养皿中剪碎组织，剪成1 mm x 1 mm x 1 mm大小。

消化：将剪碎的肿瘤组织装入含有10 mL消化液的15 mL离心管（组织碎片约2 mL），标记，用封口膜封口，放入37℃水浴锅消化1h。

冻存标本处理：分别标记好，放入-80℃冰箱保存。

终止消化：向消化好的悬液中加入1 mL FBS（40130ES），终止消化，使劲吹打细胞悬液。

过滤：吹打后静置一会儿，吸取消化后的组织上清液，用70 mm的滤网过滤。

离心：200 g离心3 min。

裂红：加入1 mL红细胞裂解液（40401ES）裂解3-5 min，然后再加入等量AdDF+++终止消化，并200 g离心5 min。

洗涤：弃去上清液，用1 mL AdDF+++重悬细胞沉淀，转移至1.5 mL EP管（83503ES）。

离心：200 g离心3 min。

洗涤：观察细胞沉淀多少，弃去上清液，用1 mL AdDF +++重悬细胞沉淀。

离心：200 g离心3 min。

铺胶：向EP管中加入适量基质胶（Ceturegel）（40192ES），每孔约30-50 mL，快速铺到24孔板（84013ES）中，37℃静置30 min使胶交联。

待基质胶稳定后，边孔加PBS，类器官每孔加适量培养基，并将孔板转移至加湿的37℃ 5% CO₂培养箱中。

每3-4天更换一次培养基，每1-4周给类器官传代。

稍微离心后，去除上层的培养基，加入1 mL Cebrary^® Cell recovery solution for Organoid（41421ES）。

将基质胶悬液进行消化，4℃消化约30 min。

在1.5 mL EP管中加入等体积的AdDF+++终止消化。

200 g离心3 min，弃去上清。

在1.5 mL EP管中加入1 mL培养基洗涤。

200 g离心3 min，弃去上清。

用基质胶重悬细胞沉淀，铺板，胶固化，每孔使用蓝枪尖缓慢加入适量的培养基。