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打破常规 LAMP 检测,更灵敏的耐热 Bst DNA 聚合酶闪亮登场!

环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)使用具有链置换特性的Bst DNA聚合酶,在等温条件(60-65℃)下高效、快速、特异性扩增靶标序列,可在15-60分钟内实现109-1010倍的扩增。等温扩增因其反应快速、特异高、设备简单易操作、结果易于鉴定等优点,特别适合资源有限的现场检测和即时诊断。目前LAMP技术已从实验室逐渐走向检验一线,覆盖包含临床传染病检测、疫情防控、海关检疫、食品与药品安全检测、环境监测等各种领域,已经成为一种适用于分子POCT平台的理想方法。

高温LAMP/RT-LAMP技术

目前LAMP/RT-LAMP反应推荐温度为60-65℃,在该温度下,存在靶标核酸模板变性不彻底,样本中存在的抑制剂难以被灭活等问题,从而可能造成模板利用率不高或模板被降解等现象,最终导致LAMP/RT-LAMP检测灵敏度受限。众多研究表明,提高等温扩增反应温度可以提升灵敏度[1]和特异性,减少原始临床样本的扩增抑制[2],无需样本精提处理可直扩[3]

图1. 不同温度下等温扩增LAMP扩增检测【4】.
Bst-LF为母本菌株,不耐高温;Br512wt和Mut 235为耐热菌株.

Paik I团队在Biochemistry上发表的研究表明【4】:(1)在常规65℃ LAMP扩增反应下,筛选出的耐热菌株(Br512wt和Mut 235)的扩增效率比母本菌株(Bst-LF)更高;(2)通过提高反应温度更利于提升耐热菌株的扩增效率和灵敏度:检测时间普遍缩短5-10min,且Mut 235菌株荧光值提高了15%左右。

由此可见,等温扩增(LAMP/RT-LAMP)反应的温度主要受限于核心酶原料的热稳定性,因此开发热稳定性提升的Bst DNA聚合酶和MMLV逆转录酶对LAMP/RT-LAMP技术升级具有重要意义。

翌圣与苏州医工所、华东理工联合开发全系列耐热等温扩增核心酶

为解决传统等温扩增出现的灵敏度低、特异性差等难点,基于国家项目《高性能等温扩增核心酶与量产工艺开发》,翌圣与苏州医工所和华东理工三方联合,通过ProStaB/FADS的高通量双功能酶分子改造平台,共同开发了全系列高温耐热等温扩增核心酶,在高温(70℃)条件下提升了反应扩增效率、增强扩增灵敏度和特异性、提高了实验稳定性。

图2.耐热Bst DNA聚合酶突变体筛选

(a)耐热Bst DNA聚合酶突变体筛选(Tm值);(b)高温(70℃)RT-LAMP扩增反应

图2表明:通过改造Bst DNAP的热稳定性,相比Parent(母本),突变体Bst22的Tm值提高了2.9℃,且耐热Bst22酶(Yeasen Cat#14410ES)搭配高温耐热MMLV逆转录酶(Yeasen Cat#14612ES)能耐受70℃高温RT-LAMP反应。以下是14410部分测试数据展示:

扩增速度快

图3. 14410扩增性能测试

以非洲猪瘟DNA为模板,添加量为10 ng/T,各厂家Bst单酶搭配各自buffer体系,翌圣 Bst酶14410扩增Ct值均小于Supplier A和Supplier B,表明14410扩增速度更快。

灵敏度高

图4. Bst酶14410灵敏度测试

以gDNA为模板,搭配翌圣13762的buffer体系,考察14410在65℃和70℃的扩增能力。图a添加量为2ng/uL的模板,图b模板浓度梯度降低,结果表明:14410可耐受70℃的LAMP反应,且提高温度,检测Ct值显著缩小,表明耐热Bst酶可进一步提升体系的灵敏度。

翌圣生物作为生命科学工具供应商,为高温等温扩增体系匠心开发全系列高品质高性能的核心原料酶——耐热Bst DNA聚合酶(Yeasen Cat#14410ES),匹配高温RT-LAMP体系的耐热MMLV逆转录酶(Yeasen Cat#14612ES)、RNase抑制剂(Yeasen Cat#14675ES)和其他酶(如热敏UDG酶、Cas12b和RNase HII),助力客户开发检测灵敏度和特异性更优的分子诊断试剂,共同提升人类病原及动物疫病的高效检测。

产品推荐

产品类型

产品名称

货号

耐热Bst DNA聚合酶

Hieff® Super Bst DNA Polymerase(2,000 U/μL)

14410ES

基础buffer

10× Hieff® Bst Plus DNA Polymerase Buffer

15441ES

耐热MMLV逆转录

Hifair® Super Reverse Transcriptase(200 U/μL)

14612ES

热敏UDG酶

UCF.ME® Uracil DNA Glycosylase(UDG/UNG), heat-labile, 1 U/μL

14466ES

RNase抑制剂

UCF.ME® High Affinity RNase Inhibitor (40 U/μL)

14675ES

Cas12b

AapCas12b Nuclease (10 μM)

14808ES

RNase HII

RNase HII (2 U/μL)

14539ES

参考文献:

[1] Njiru ZK, Mikosza AS, Matovu E, et al. African trypanosomiasis: sensitive and rapid detection of the sub-genus Trypanozoon by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of parasite DNA. Int J Parasitol. 2008;38(5):589-599. doi:10.1016/j.ijpara.2007.09.006.

[2] Verkooyen RP, Luijendijk A, Huisman WM, et al. Detection of PCR inhibitors in cervical specimens by using the AMPLICOR Chlamydia trachomatis assay. J Clin Microbiol. 1996;34(12):3072-3074. doi:10.1128/jcm.34.12.3072-3074.1996.

[3] Fereidouni SR, Starick E, Ziller M, et al. Sample preparation for avian and porcine influenza virus cDNA amplification simplified: Boiling vs. conventional RNA extraction. J Virol Methods. 2015;221:62-67. doi:10.1016/j.jviromet.2015.04.021.

[4] Paik I, Ngo PHT, Shroff R, et al. Improved Bst DNA Polymerase Variants Derived via a Machine Learning Approach. Biochemistry. 2023;62(2):410-418. doi:10.1021/acs.biochem.1c00451

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