精品推荐│热稳定性更强的Bst DNA聚合酶，让等温扩增更灵敏、更便捷

近年来，等温扩增技术因其无需专用的仪器设备、扩增时间短、灵敏度高等特点，在现场检测和即时诊断中显示了良好的应用前景。其中，环介导等温扩增技术（loop mediated isothermal amplification, LAMP）使用具有链置换特性的Bst DNA聚合酶，可在恒温条件（60-65℃）下高效、快速、特异性扩增靶标序列，在15-60 min内即可实现10⁹-10¹⁰倍的扩增，目前已广泛应用于临床传染病诊断、环境监测、食品安全检测等领域。

表1. 常规PCR技术与等温扩增技术对比

常规PCR 技术与等温扩增技术（IAT）对比
特点	PCR	IAT
扩增	3步循环：95℃变性；-60℃引物退火；72℃聚合延伸	通常在60-65℃下恒温进行
变性	需要通过高温进行解链，以便引物结合	直接通过链置换活性DNA聚合酶完成
反应时间	至少需要90min获得结果	一般可在30min内获得结果
反应仪器	需要热循环仪	无需专用热循环仪，简单的水浴锅即可
结果观察	通过凝胶电泳后才能观察到核酸片段	通过比色/目视比浊法可直接观察结果
灵敏度	可检测纳克级别靶标	可检测飞克级别靶标
优势	技术成熟；通量较大；敏感性、特异性高	用时短；设备要求低，价格便宜；程序简单，实现全自动、一体化较简单
劣势	操作繁复，时间较长；对仪器的精密度、可靠性要求高；影响扩增因素较多	通量较低；引物设计难度大；试剂价格较高

LAMP检测方法分为多种，包括比浊法、pH显色法、荧光染料法（如NHB、钙黄绿素、SYBR Green、Syto等）、荧光探针法等，以上所有的方法都会用到关键核心酶原料Bst DNA聚合酶。

翌圣Bst DNA聚合酶

翌圣生物Hieff^® Bst Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）是将缺少5′→3′外切核酸酶结构域的Thermophilic Geobacillus sp DNA聚合酶基因在E.coli中表达纯化而得。该Bst DNA聚合酶链置换能力强，具备高灵敏度、高扩增效率、高dUTP耐受性的优势，可广泛应用于基于等温扩增技术的病原体即时检测。

灵敏度低至50 copies/T，反应时间＜15 min（荧光定量RT-LAMP法）

使用翌圣Hieff^® Bst Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）进行RT-LAMP反应，扩增新冠假病毒模板(50 copies/T)，重复20次实验。结果显示25 μL反应体系中，50 copies/T的检出率达100%，反应时间＜15 min。

图1. 翌圣Hieff^® Bst Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）检测灵敏度测试结果

高dUTP耐受性

使用翌圣Hieff^® Bst Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）进行RT-LAMP反应，扩增新冠假病毒模板(20 copies/T)。在推荐反应方案中引入dUTP/UDG酶防污染系统，使用dUTP替换dTTP。对比全U（35 mM）替换（红色扩增曲线）与T：U = 1：1（蓝色扩增曲线）的扩增结果发现，在反应体系中添加dUTP对Hieff^® Bst Plus DNA Polymerase的灵敏度及扩增效率无影响，该酶具有较高的dUTP耐受性。

图2. 翌圣Hieff^® Bst Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）高dUTP耐受性验证结果

稳定性好

使用Hieff^® Bst Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）搭配Hifair^® III Reverse Transcriptase （Cat#11111ES）配制成RT-LAMP试剂，在37℃下放置5天测试加速稳定性，在-20℃反复冻融测试冻融稳定性，结果显示，RT-LAMP试剂在37℃加速5天，反复冻融10次性能稳定。

图3. 翌圣Hieff^® Bst Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）稳定性验证结果

目前LAMP反应推荐温度为60-65℃，在该温度下，存在靶标核酸模板变性不彻底，样本中存在的抑制剂难以被灭活等问题，从而可能造成模板利用率不高或模板被降解等现象，最终导致LAMP检测灵敏度受限。众多研究表明，提高LAMP反应温度可以提升灵敏度^[1]，减少原始临床样本的扩增抑制^[2-3]。LAMP反应的温度主要受限于Bst DNA聚合酶的热稳定性，因此开发热稳定性提升的Bst DNA聚合酶对LAMP技术升级具有重要意义。

翌圣耐热Bst DNA聚合酶

为了获得适用于更高温度LAMP/RT-LAMP实验的Bst DNA聚合酶，翌圣ZymeEditor™酶改造平台对Bst DNA聚合酶进行了定向改造，目前已获得多个耐热Bst DNA聚合酶优势突变体，提升了Bst DNA聚合酶在70℃高温RT-LAMP中的扩增性能，可为期望提升LAMP实验灵敏度和开发免提取LAMP/RT-LAMP产品的客户提供测试装。

图4. 通过改造Bst DNA 聚合酶的热稳定性，相比母本，突变体M22的Tm值提高了2.9℃，能耐受70℃高温RT-LAMP反应

翌圣LAMP相关产品选择指南

产品定位	产品名称	产品货号
高灵敏度Bst酶	Hieff® Bst Plus DNA Polymerase (40 U/μL)	14402ES
适合RT-Lamp的逆转录酶	Hifair® III Reverse Transcriptase (200 U/μL)	11111ES
RNase抑制剂	Murine RNase inhibitor (40 U/μL)	10603ES
防污染UDG酶	UCF.ME® Uracil DNA Glycosylase(UDG/UNG), heat-labile, 1 U/μL	14466ES
荧光染料法RT-Lamp试剂盒	RT-LAMP Dye Assay Kit (UDG plus)	13762ES
pH指示剂法RT-Lamp试剂盒	RT-LAMP pH Sensitive Dyestuff Kit	13906ES

注：翌圣单酶系列均可提供高低浓度、无甘油等不同产品形式。

参考文献

[1] Njiru ZK, Mikosza AS, Matovu E, et al. African trypanosomiasis: sensitive and rapid detection of the sub-genus Trypanozoon by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of parasite DNA. Int J Parasitol. 2008;38(5):589-599. doi:10.1016/j.ijpara.2007.09.006.

[2] Verkooyen RP, Luijendijk A, Huisman WM, et al. Detection of PCR inhibitors in cervical specimens by using the AMPLICOR Chlamydia trachomatis assay. J Clin Microbiol. 1996;34(12):3072-3074. doi:10.1128/jcm.34.12.3072-3074.1996.

[3] Fereidouni SR, Starick E, Ziller M, et al. Sample preparation for avian and porcine influenza virus cDNA amplification simplified: Boiling vs. conventional RNA extraction. J Virol Methods. 2015;221:62-67. doi:10.1016/j.jviromet.2015.04.021.