Hieff NGS^® OnePot Pro DNA Fragmentation Reagent是针对Illumina^®与MGI^®高通量测序平台设计的新一代酶切法建库试剂。本品采用高质量的片段化酶，摆脱了繁琐的超声过程，同时简化了操作流程，将片段化模块与末端修复/加A模块合二为一，极大的降低了建库的时间和成本。可应用于500 pg-1 μg常规动植物基因组、微生物基因组等样本，在单管内实现DNA的片段化、末端修复和A尾添加反应。反应产物无需纯化，即可使用Hieff NGS^® Fast-Pace^TM DNA Ligation Module（Cat#12607）或Hieff NGS^® Novel DNA Ligation Module（Cat#12626）进行文库构建中接头连接反应。

 

产品组分

组分编号	组分名称	24 T	96 T
12619-A	Smearase® Buffer	240 μL	960 μL
12619-B	Smearase® Enzyme	120 μL	480 μL

 

运输与保存方法

干冰运输。-25~-15℃保存，有效期18个月。

 

注意事项

1. 本试剂盒兼容范围为500 pg - 1 μg Input DNA。应尽可能使用A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.0的高质量Input DNA。

2. 若Input DNA中引入高浓度金属离子螯合剂或其他盐，可能会影响后续实验，建议将DNA稀释在TE（10 mM Tris-HCl ,1 mM EDTA，pH 8.0）中进行片段化。

表1  常规基因组DNA片段化时间选择表                               

插入片段主峰大小	片段化时间	优化范围
600 bp	8 min	6-12 min
350 bp	10 min	8-14 min
250 bp	12 min	10-15 min
200 bp	15 min	13-18 min
150 bp	20 min	15-25 min

 表2  FFPE DNA片段化时间选择表

插入片段主峰大小	片段化时间	DIN*
250 bp	9-13 min	> 8.0
250 bp	8-11 min	6.5-8.0
250 bp	4-8 min	4.2-6.5
250 bp	3-6 min	2.5-4.2

【注】：*DIN为DNA Integrity Number，是用Agilent 2200来定义FFPE DNA降解程度的一种方法。

3. 对于常规的高质量基因组DNA，酶切时间参考表1，本试剂盒片段化偏好低，耐受各种GC含量的模板。对于不同降解程度的FFPE样本，酶切时间参考表2。以上为推荐时间，需客户在自己的实验体系中进行微调，以达到最佳效果。

4. 参照片段化步骤推荐条件可将DNA酶切为所需大小，为保证优质稳定的片段化效果，片段化过程请于冰上操作。

5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

使用方法

DNA片段化/末端修复/dA尾添加（DNA Fragment/End Preparation/dA-Tailing）

该步骤将基因组DNA片段化，同时进行末端修复及dA尾添加。

1. 将表3中试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于冰上配制表3反应体系。

表3  DNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应体系

名称	体积（μL）
Input DNA	x
Smearase® Buffer	10
Smearase® Enzyme	5
TE	Up to 60 μL

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将上述PCR管置于PCR仪，设置表4所示反应程序，进行DNA片段化，末端修复及dA尾添加反应。

表4  DNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应程序

温度	时间
热盖105°C	On
4 °C	1 min*
30 °C	3-20 min**
65 °C	20 min
4 °C	Hold

【注】：*DNA片段化过程为有效控制片段化效果，避免过度酶切，反应程序可预先设置4℃，待模块温度降至4℃时，将PCR管放入PCR仪即可。**对于完整的基因组DNA，酶切时间参考表1，Input DNA 500-1000 ng，可根据具体需求，适当延长酶切时间2-4 min左右；对于质量不一的FFPE DNA样本，酶切时间参考表2。

5. 产物如需纯化，可使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads（Cat#12601）或AMPure XP Beads（Cat#A63880）或其他等效产品。也可以直接驳接Hieff NGS^® Novel DNA Ligation Module（Cat#12626）或Hieff NGS^® Fast-Pace DNA Ligation Module（Cat#12607）试剂盒，进行接头连接。详细说明请见后者的说明书。

 

参考实例

使用Hieff NGS^® OnePot Pro DNA Fragmentation Reagent对200 ng Human gDNA (NA12878) 样本进行酶切建库检测，片段化结果见图1。

图1  OnePot Pro DNA建库试剂盒酶切200 ng Human gDNA样本（不同酶切时间片段化效果检测）

HB230215