干货分享|片段化酶——NGS酶切法建库中的后起之秀
NGS建库江湖中，超声打断（机械法）建库历来被视为“经典大家”。然而酶法片段化，凭借其便捷、经济、高效的片段化方法，从初出茅庐到力排众议，一跃成为后起之秀的典范。目前片段化酶法打断建库已经占有一席之地，但距离攻城略地依然任重道远。片段化酶优化之路，道阻且长，唯有上下而求索，方能从容而为。
行业趋势-百家争鸣，百花齐放
对于dsDNA片段化，超声打断堪称一代宗师。打断的DNA片段更为集中且无偏好性，是目前NGS建库中片段化的金标准，但超声打断也有其无法克服的局限性，比如：仪器耗材成本居高不下、DNA损伤等也让竞争激烈的NGS下游服务企业望而却步。同时期亦有勇者不断涌出，其中片段化酶就是现阶段NGS建库的热点使用方法。
市面上，片段化酶种类较多，但大都基于内切酶原理。对于不同的片段化酶来说，Tn5依然是NGS市场上极速建库的王者，但其在建库中所表现出的偏好性也使得其应用颇为局限。因此像DNase Ⅰ、Endonuclease Ⅴ以及Fragmentase等虽在市场上初露锋芒，但也因其各自的不足尚未被完全开发利用。而Fragmentase则是目前NGS端最为大众所熟知的片段化酶。
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酶类 |
Endonuclease V |
Fragmentase |
Tn5 |
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组成 |
单酶 |
单酶 |
混合酶 |
单酶 |
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类型 |
内切酶 |
内切酶 |
内切酶 |
转座酶 |
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作用原理 |
在不同的阳离子存在的条件下，可将DNA随机酶切为所需的DNA片段。 |
通过调整DNA中尿嘧啶的含量可控制DNA酶切的长度。 |
一种酶产生缺刻，另一种酶识别缺刻位点并在互补链上切割，将DNA酶切为所需的DNA片段。 |
利用转座子的特性随机插入DNA上的某一位置，产生随机的DNA片段。 |
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不足 |
实验受多种因素影响，重复性不佳；此外酶切位点具有一定的偏好性。 |
由于碱基序列组成的差异，样本的GC含量对片段化的效果有潜在的影响，实际操作中也会受到诸多因素的影响。 |
/ |
转座酶插入位点的左右9个碱基有一定的偏好性。 |
图1.不同片段化酶作用原理和优劣势
革故鼎新，升级换代
对于Fragmentase片段化酶，当前NGS领域中产品形式上主要分为两种：片段化试剂（酶+buffer)、片段化/末修/加A一体化模块。前者产品形式灵活，可满足不同客户的需求，而后者使产品操作流程更为精简。众所周知，目前的片段化反应上主要是时间和温度依赖性，目前已知的商业化的DNA片段化酶从原理上主要分为两大类：
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基于NEB专利的双酶片段化体系，由突变体Vvn和突变体T7 endonuclease I组成。
-
基于随机切割DNA的非限制性核酸内切酶，比如Dnase I、endonuclease V等或其突变体。
其中，翌圣生物十年匠心，专注于分子工具酶原料的生产和开发，致力于成为分子酶产业创新引领者。凭借双向酶改造平台和自身成熟的分子酶研发经验，经过多年的潜心研究与体系优化开发出自身专利的片段化单酶。翌圣专利的片段化酶Smearase主要是非限制性核酸内切酶的突变体，单酶体系。酶切效果仅与酶切时间有关而与样本类型GC含量以及Input DNA无关。此外，受EDTA耐受性较强，已验证可耐受2 mM的EDTA。以此为核心的酶切法建库试剂盒Hieff NGS® OnePotⅡ DNA Library Prep Kit for Illumina®&MGI®摆脱了繁琐的超声过程，同时简化了操作流程，极大的降低了建库的时间和成本，并且针对FFPE样本、WGA产物和长扩增子等复杂样本也能获得优异的测序结果。
图2. YEASEN片段化酶耐受2 mM EDTA打断效果
（1×TE buffer酶切体系EDTA额外添加0.375 mM(1.125 mM），30度酶切8 min主带无明显变化）
但是在实际应用中发现，针对不同的样本类型或不同的提取试剂盒采用相同的打断时间往往无法获得一致的打断结果，有时需要针对个别样本额外调整打断时间。因此，翌生生物一直致力于开发出高质量片段化酶可同时兼容市场不同的需求。最终经过特殊优化，筛选出更高质量的新片段化酶-OnePot Pro系列，同时打断体系中对部分溶解体系中额外添加Conditioning Solution可进一步平衡反应体系，对于不同的样本类型可在统一的打断条件下反应。而且OnePot Pro系列片段化酶建库后测序数据显示打断的偏好性更低，无GC bias等，可进一步满足市场的不同需求。
图3. 不同DNA buffer（H2O、TE、EB和AE），相同打断时间，搭配TE均一化后基本一致
图4. OnePot Pro片段化酶打断后测序质量分析显示极低偏好性
精品推荐
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试剂类别 |
产品名称 |
货号 |
规格 |
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片段化酶 |
OnePot |
12907ES24/96 |
24T/96T |
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OnePot Pro |
Hieff® Smearase Pro |
12917ES24/96 |
24T/96T |
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片段化/末修/加A模块 |
OnePot |
Hieff NGS® Fast-PaceTM DNA Fragmentation Reagent 快速片段化/末端修复/A尾添加模块 |
12609ES24/96 |
24T/96T |
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OnePot Pro |
12619ES24/96 |
24T/96T |
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建库试剂盒 |
OnePot |
Hieff NGS® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina® 一步法DNA建库试剂盒 |
12203ES24/96 |
24T/96T |
|
OnePot Pro |
12205ES24/96 |
24T/96T |
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护卫科研，任重道远
必将上下求索，孜孜不倦
攻坚克难，问鼎原料酶前沿高峰
