最近小翌在后台收到消息，说建库的片段化仪器坏了，不能做超声打断，问有没有其他核酸打断的方法推荐。干货来啦！

下面小翌就来给大家讲一讲吧~

核酸打断的方法可以分为机器法和试剂法。
其中机器法包含接触式和非接触式，接触式主要包括探头式和水浴超声两大类，这类方法比较实惠，但是直接接触样本会导致样本损耗和污染，非接触式主要包括Diagennode和Covaris这两个品牌，这类仪器和耗材的成本太高，单个样本的耗材成本达20-50元。
试剂法指的是采用片段化酶对核酸进行打断，这类方法成本较低，操作简便省时，只需要在样本中加入片段化酶，再反应一段时间即可完成反应。市面上报道可用于核酸打断的片段化酶有很多，包括应用于高通量测序的Tn5转座酶、NEB公司推出的Fragmentase、DNase I和Endonuclease V等。这里小翌就借花献佛，将试剂法核酸片段化酶的资料整理出来与大家分享。

DNase Ⅰ

DNase I（Deoxyribonuclease I）：中文名称为脱氧核糖核酸酶I，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。DNase I水解单链或双链DNA后的产物，5'端为磷酸基团，3'端为羟基。DNase Ⅰ酶切底物DNA通常依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。

常见应用：

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在镁离子存在条件下，DNase I随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNase I可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。

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图 DNase Ⅰ在Mg²⁺以及Mn²⁺存在下可切割dsDNA。图片来源于Thermo

DNase Ⅰ在不同的离子存在下可以片段化dsDNA，然后实际操作中却易受到多种条件的影响，如酶的用量，反应温度，底物DNA的纯度等。此外研究发现DNase Ⅰ对嘧啶核苷酸旁边位点有偏好性，大大影响终文库的多样性[1]。

Endonuclease V

核酸内切酶 V 是在E. coli 中发现的一种 DNA 修复酶。其识别脱氧肌苷（脱氧腺苷在DNA中的脱氨基产物），对错配的脱氧肌苷3´ 端第二个磷酸二酯键进行切割，产生一个 3´ 羟基、5´ 磷酸的切刻。除此之外在较小程度上可以识别AP位点，基因错配的DNA位点，插入/缺失不匹配等位点。

常见应用：

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图Endonuclease V可识别AP位点或尿素、碱基错配、插入/缺失错配、发夹结构的 DNA。图片来源于Thermo

2002年，日本学者Kentaro Miyazaki使用Endonuclease V用于DNA样本的随机片段化。由于Endonuclease V可特异性识别尿嘧啶，因而可以通过调节DNA中尿嘧啶的残留量来控制最终Endonuclease V酶切的长度。结果表明在没有dUTP的情况下，DNA不会被酶切（Lane 1），当dTTP/dUTP的比例降低时，片段的平均长度也随之降低（Lane 2，3，4），当dUTP完全替代dTTP的时候，DNA会被切割的很短（Lane 5）^[1]。

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图不同的dTTP/dUTP浓度比例条件下，DNA被酶切后的片段分布电泳图

Endonuclease V一般识别特定的位点，本研究中通过PCR随机引入尿嘧啶可用于DNA的随机片段化。由于碱基序列组成的差异，样本的GC含量对Endonuclease V片段化效果有潜在影响，实际操作中尤其是NGS应用中也会受到诸多条件的限制。

dsDNA Fragmentase

dsDNA Fragmentase是NEB公司推出的一款片段化酶，以单酶的形式出售。该产品实际上是两种酶按一定比例组合成的混合酶体系，一种酶在DNA双链上随机产生缺刻，另一种酶识别这个缺刻并在互补链上切割，从而产生DNA双链断裂。Fragmentase进行双链DNA片段化反应后产生带有5’磷酸和3’羟基的短突出粘性末端DNA片段。

该酶通过改变酶切时间将DNA酶切至特定大小的DNA片段，与初始的Input DNA量以及Input DNA长度无关。

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图不同起始量的gDNA不同酶切时间后的片段分布。图片来源于NEB官网

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图不同长度的gDNA不同酶切时间后的片段分布。图片来源于NEB官网

Tn5

Nextera^XT技术相信大家都不陌生，2011年1月，Illumina宣布收购Epicentre生物技术公司，于是理所当然的Epicentre公司的Nextera技术核心也归illumina公司所有。

Nextera^XT将P5/P7端部分接头序列和转座子末端序列形成包被接头与Tn5形成转座复合体，该复合体会打断受体DNA，形成一端带有P5部分的Adapter1,一端带有P7部分Adapter2的DNA，之后通过PCR加上index序列以及接头其余部分，形成完整的文库，整个建库流程仅需90 min。

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图 Tn5转座酶建库原理示意图

Tn5也借此引爆极速建库之战，而竞争对手也并没有坐以待毙，Thermo用Mu转座酶推出了Museek Library Preparation Kit for Ion Torrent；Agilent 推出Vibrio(哈式弧菌)，Vibrio与Tn5序列之间的相似性高达40%。尽管如此，其市场反馈以及实际情况都不如Tn5。

同时Tn5由于其片段化的偏好性经常受到竞争对手的诟病。据统计Tn5在插入位点两侧9个碱基左右有明显的偏好性。

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图转座酶插入位置前后9碱基左右有明显的偏好性。图片来源于网络

片段化酶小结

类别	DNase I	Endonuclease V	Fragmentase	Tus
组成	单酶	单酶	混合酶	单酶
类型	内切酶	内切酶	内切酶	转录酶
作用原理	在不同的阳离子存在的条件下，可将DNA随机酶切为所需的DNA片段。	通过调整DNA中尿嘧啶的含量可控制DNA酶切的长度。	一种酶产生缺刻，另一种酶识别缺刻位点并在互补链上切割，将DNA酶切为所需的DNA片段。	利用转座子的特性随机插入DNA上的某一位置，产生随机的DNA片段。
不足	实验受多种因素影响，重复性不佳；此外酶切位点具有一定的偏好性。	由于碱基序列组成的差异，样本的GC含量对片段化的效果有潜在的影响，实际操作中也会受到诸多因素的影响。	/	转座酶插入位点的左右9个碱基有一定的偏好性。

片段化酶与NGS

NGS因其检测灵敏度高，特异性高且兼具定性和定量检测，在NIPT，肿瘤基因突变，PGD/PGS等领域展现了极为广阔的临床与科研应用前景。

然而受限于平台测序读长短的不足，建库前需随DNA进行随机打断。目前主要是以机械法为主（如Covaris），但是超声本就是物理方法打断，会对DNA造成明显的损伤，且超声仪器与耗材成本居高不下，这对竞争激烈的NGS下游服务企业来说，成本太过高昂。因而这也将是以片段化酶+常规建库试剂搭配的酶切法建库试剂盒进入市场的重要契机。

对于不同的片段化酶来说，Tn5依然是目前市场上极速建库的王者，然而另一方面Tn5在建库中所表现出的偏好性也使得不少的客户望而却步。因此像DNase Ⅰ、Endonuclease Ⅴ以及Fragmentase在市场上初露锋芒，其中DNase Ⅰ与Endonuclease Ⅴ因其各自的不足尚未被完全开发利用，Fragmentase则是目前NGS端大众所熟知的片段化酶。

精品推荐

翌圣生物结合自身分子酶的创新研发，推出片段化酶Smearase，本产品酶切效果仅与酶切时间有关而与样本类型GC含量以及Input DNA无关。以此为核心的酶切法建库试剂盒Hieff NGS^® OnePotⅡ DNA Library Prep Kit for Illumina摆脱了繁琐的超声过程，同时简化了操作流程，极大的降低了建库的时间和成本。并且针对FFPE样本也能获得优异的测序结果。

产品特点：

1、操作简便：片段化/末端修复/加A一步完成

2、稳定酶切：酶切效果仅与时间有关，不受物种类型与Input DNA影响

3、偏好性低：酶切偏好性远低于Tn5

4、适用范围广：不仅适用于常规gDNA，cDNA，还适用于FFPE等样本

性能展示：

图不同酶切时间后样本片段分布情况

订购/试用装信息

类型	名称	货号	规格
试剂盒	Hieff NGS^® OnePotⅡ DNA Library Prep Kit for Illumina^®	12204ES08	8 T
		12204ES24	24 T
		12204ES96	96 T
片段化酶	Hieff^® Smearase	12907ES08	8 T
		12907ES24	24 T
		12907ES96	96 T

参考文献：

Miyazaki K. Random DNA fragmentation with endonuclease V: application to DNA shuffling. Nucleic Acids Res. 2002 Dec 15;30(24):e139.