ACE2即血管紧张素转化酶II（Angiotensin-converting enzyme2），是I型整合膜蛋白，广泛分布于肺部、心脏和肾脏等组织，可以调节血压和体液平衡；同时也是冠状病毒的功能受体，介导病毒入侵和细胞融合。ACE2主要包括N端PD区（Peptidasedomain）和C端CLD区（Collectrin-likedomain），其中位于胞外的PD区可结合新冠病毒S蛋白的RBD（Receptor bindingdomain），且在特定蛋白酶的帮助下，S蛋白可诱导ACE2胞外区脱落，继而由ACE2胞内结构来帮助病毒的入侵和感染。本细胞系是将ACE2过表达慢病毒感染293T细胞并筛选得到的稳定株。
使用方法
1. 细胞复苏
1）细胞冻存密度为5E6 cells/mL，冻存管分装1 mL。
2）在37 ℃水浴锅预热培养基，将9 mL预热完全培养基加入到15 mL离心管中；
3）从液氮中取出冻存的细胞并迅速放入37 ℃水浴锅中，将细胞液面浸至水面以下，轻轻摇动至融化；
4）用70%乙醇擦拭冻存管外部以降低污染的几率；
5）在生物安全柜或超净台中将冻存管中的细胞悬液转移到预先加有预热好的15 mL的离心管中，轻轻混匀，离心5min、转速800 rpm，使细胞沉淀，弃上清。
6）使用15 mL培养基重悬细胞，此时活细胞密度应为2E5-3E5 Cells/mL。可取出部分使用台盼蓝染色计数活细胞。
7）将细胞接种到1个10 cm培养皿（10 mL,培养面积78 cm2）和1个6 cm培养皿（5 mL,培养面积28 cm2）中。此时细胞密度应为：20~30%。
8）放入37 ℃恒温培养箱中孵育24 h，镜下观察细胞贴壁情况，如已贴壁，根据细胞密度，小心更换培养基或进行细胞传代。当细胞密度大于60%时，即可进行传代，细胞密度不可大于80%。如未完全贴壁，继续孵育至48 h。
9）首次复苏后，约48 h可进行第一次传代。
【注】：推荐细胞培养基和冻存液如下：
| 细胞复苏培养基： | DMEM+10% FBS+1%双抗 |
| 细胞生长培养基： | DMEM+10% FBS+1%双抗+0.75 μg/mL嘌呤霉素 |
| 细胞冻存培养基： | 90%FBS+10%DMSO |
2. 细胞传代
1）细胞消化液：0.25% Trypsin-EDTA，消化时间为：30-60 s。
2）贴壁细胞按细胞密度（汇合度）进行传代，推荐细胞传代比例为1:4-1:5，隔天传代。
【注】：细胞密度大于60%即可进行传代，细胞密度不可高于80%。
3）吸出皿或培养瓶中的细胞培养液，然后用适量的PBS润洗1~3次。
4）弃PBS，加1 mL细胞消化液，37 °C培养箱中消化30~60 s，显微镜下观察待细胞变圆，细胞间隙明显，部分细胞刚开始脱离瓶壁。
5）加2 mL左右完全培养液混匀终止消化，将细胞小心吹打下来，室温离心5 min，转速800 rpm/min。
6）弃上清，细胞沉淀用完全培养液重悬，根据传代前细胞密度分盘（根据培养皿面积和细胞密度计算，传代后细胞密度为20-30%）。
【注】：贴壁细胞典型密度与细胞数量如下：
| 培养皿 | 培养基（ mL） | 面积（cm2） | 接种细胞量 | 汇合度100% |
| 35 mm Dish | 2 | 9.6 | 3.2 × 105 | 1.3 × 106 |
| 60 mm Dish | 5 | 28 | 7.8 × 105 | 3.1 × 106 |
| 100 mm Dish | 10 | 78 | 2.3 × 106 | 9.0 × 106 |
| T-25 Flask | 5 | 25 | 6.9 × 105 | 2.6 × 106 |
| T-75 Flask | 10 | 75 | 2.1 × 106 | 8.4 × 106 |
3. 细胞冻存
1）2×细胞冻存液：80% FBS+20% DMSO；
2）细胞计数后，1000 rpm，3 min离心收集细胞；
3）使用预冷的FBS调节细胞密度至2×；
4）加入与FBS等体积的2×细胞冻存液，轻轻混匀；
5）每管1 mL分装到细胞冻存管中，冻存体积为1 mL，冻存密度为5E6 cells/mL；
6）拧紧盖子，适当标记后，将细胞冻存管置于梯度降温盒中，在-80 ℃下保存至少1天，尽快转移至液氮中。
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干冰运输。收到之后如不立即复苏，请立即转入液氮储存。
【注】：收到产品后，请立即确认产品是否为冻存状态。
[1] Wu X, Cheng L, Fu M, et al. A potent bispecific nanobody protects hACE2 mice against SARS-CoV-2 infection via intranasal administration. Cell Rep. 2021;37(3):109869. doi:10.1016/j.celrep.2021.109869(IF:9.423)
[2] Wu X, Wang Y, Cheng L, et al. Short-Term Instantaneous Prophylaxis and Efficient Treatment Against SARS-CoV-2 in hACE2 Mice Conferred by an Intranasal Nanobody (Nb22). Front Immunol. 2022;13:865401. Published 2022 Mar 17. doi:10.3389/fimmu.2022.865401(IF:7.561)
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