冠状病毒是一类正股RNA病毒，病毒颗粒包膜上的刺突（S）糖蛋白（下称S蛋白）通过它的受体结合域（RBD）介导受体识别，并在S蛋白裂解成S1和S2亚基后进行膜融合。MERS-CoV刺突蛋白(Spikeprotein, S)受体结合域(receptor-bindingdomain, RBD)可特异性地识别和结合细胞表面受体二肽基肽酶(dipeptidylpeptidase, DPP4)，介导病毒细胞入侵和感染。同时，RBD也是MERS-CoV中和抗体表位富集区，针对RBD中和抗体既可以特异性阻断MERS-CoV对DPP4受体表达细胞的感染，又可以特异性阻断RBD与DPP4受体表达细胞的结合。

本细胞系是将DPP4过表达慢病毒感染293T细胞并筛选得到的稳定株。

使用方法

1、细胞复苏

1）在37℃水浴锅预热培养基，将5 mL预热完全培养基加入到15 mL离心管中。

2）从液氮中取出冻存的细胞（5E6 cells/mL）并迅速放入37℃水浴锅中，将细胞液面浸至水面以下，轻轻摇动至融化。

3）用70%乙醇擦拭冻存管外部以降低污染的几率。

4）在生物安全柜内将冻存管中的细胞悬液转移到预先加有预热好的15 mL离心管中轻轻混匀，1000 rpm离心5min，使细胞沉淀，弃上清。

5）使用1 mL培养基重悬细胞，此时活细胞密度应为3.5E6-5E6 cells/mL。可取出部分细胞并使用台盼蓝染色计数活细胞。

6）将细胞接种到1个10 cm培养皿（10 mL，培养面积78 cm²）和1个6 cm培养皿（5 mL，培养面积28 cm²）中，细胞密度应为：20~30%。

7）放入37℃恒温培养箱中孵育24h，镜下观察细胞贴壁情况，如已贴壁，根据细胞密度小心更换培养基或进行细胞传代。当细胞密度大于60%时，即可进行传代，细胞密度不可大于80%。如未完全贴壁，继续孵育至48h。

8）首次复苏后，约48h可进行第一次传代。

【注】：推荐细胞培养基和冻存液如下：

2、细胞传代

1）使用0.25% Trypsin-EDTA消化30-60 s。

2）贴壁细胞按细胞密度（汇合度）进行传代，推荐细胞传代比例为1:4-1:5，隔天传代。

【注】：细胞密度大于60%即可进行传代，细胞密度不可高于80%。

3）吸出皿或培养瓶中的细胞培养液，用适量的PBS润洗1~3次。

4）弃PBS，加1 mL细胞消化液，于37°C培养箱中消化30~60s，镜下观察待细胞变圆，细胞间隙明显，部分细胞刚开始脱离瓶壁。

5）加2 mL左右完全培养液混匀终止消化，将细胞小心吹打下来，室温离心1000 rpm、3min。

6）弃上清，细胞沉淀用完全培养液重悬，根据传代前细胞密度分盘（根据培养皿面积和细胞密度计算，传代后细胞密度为20-30%）。

3、细胞冻存

1）2×细胞冻存液：80%FBS+20%DMSO。

2）细胞计数后，1000 rpm，3min离心收集细胞。

3）使用预冷的FBS调节细胞密度至2×。

4）加入与FBS等体积的2× 细胞冻存液，轻轻混匀。

5）每管1 mL分装到细胞冻存管中，冻存体积为1 mL，冻存密度为5E6 cells/mL。

6）标记后，将细胞冻存管置于梯度降温盒中，在-80℃下保存至少1天，尽快转移至液氮中。

收到之后如不立即复苏，请立即转入液氮储存。