实验室养细胞的小伙伴，是不是遇到过细胞养不好的情况？胎牛血清（FBS）作为细胞培养里最关键的一项组分，对细胞培养的状态起着至关重要的作用，因此我们总结了一些使用中要注意的各种tips供大家参考，记得收藏哦。

Q

胎牛血清买回去如何保存？

胎牛血清常规储存在-20℃即可，但如果想长时间储存可以保存在-80℃，尽量不要多次冻融。如果确定要溶解多次，最好按照每次用量先提前分装，分装后再一起冻存，用时按需解冻即可，或者直接采购小规格50 mL，使用方便快捷。

Q

胎牛血清使用时候如何解冻？

解冻时候推荐从低温中取出后，放置于2-8℃冰箱中解冻（可过夜），使其部分溶解，然后在室温条件下使其全部融解，溶解过程中须不时的摇动瓶身，混合里面的液体。建议采取此种方式解冻，可有效降低沉淀的产生。不建议直接从低温拿到25-37℃环境中解冻，容易产生絮状沉淀，并且在25-37℃环境中滞留的时间越长，越容易影响血清中一些物质的活性，继而影响细胞培养状态、增殖速率等。

Q

胎牛血清解冻后出现的沉淀是什么？为什么会有沉淀？还能继续使用吗？

血清中出现的沉淀物质可能包括纤维蛋白（絮状沉淀）、脂蛋白、冷凝集素、玻连蛋白、胎球蛋白、磷酸钙与草酸钙（显微镜下小黑点沉淀）及胆固醇等。

图1 纤维蛋白形态图

这是最常见的沉淀物之一，体积较大，可达1-2 mm，肉眼可见。纤维蛋白的形成主要是由于血清中的纤维蛋白原在解冻后凝结。纤维蛋白是形成凝血的蛋白质之一，通常以絮状沉淀的形式出现，可以通过离心的方法去除。（比如400~600 g离心5 min，取血清上清液。）

图2 .磷酸钙结晶形态图

这种沉淀物会使血清浑浊，并且在37℃培养时会增加。磷酸钙在显微镜下观察像小黑点，有时会被误认为是微生物污染。

图3 .草酸钙结晶形态图

草酸钙沉淀物在血清中的形成与草酸和钙离子的结合有关。草酸是一种有机酸，当它与钙离子结合时，会形成不溶于水的草酸钙沉淀物。

如果需要去除沉淀物，可以采用离心的方法。例如，将血清分装至无菌离心管内，以400-600 g离心5 min，取上清液使用。不建议过滤去除沉淀物，因为这可能会阻塞过滤膜或导致营养成分流失。

产品沉淀的原因较多，主要有以下几种：

(1) 温度变化：血清在解冻过程中如果温度变化过大(如从-20℃直接放入37℃), 容易产生沉淀物。

(2) 反复冻融：反复的冻融过程会导致沉淀物的增多。

(3) 热灭活：热灭活血清会显著增加沉淀物的形成。

(4) 长时间储存：血清在室温或低温冰箱中放置时间过长，不稳定成分会被破坏，导致沉淀物的产生。

沉淀物本身不影响血清质量，不会直接影响细胞的生长和增殖，只是沉淀如果覆盖到细胞上面形成一层膜，可能会影响细胞对于营养物质的吸收，所以如有需要，把血清加入到培养基后，离心去除沉淀即可。

Q

胎牛血清使用前是否需要额外过滤？

血清出厂前都经过严格的无菌处理和质检，如果单从细菌这一块考虑的话，是不需要额外过滤的，如果考虑到沉淀物，可以采取400-600 g离心5 min去除沉淀，必要时候可以加入培养基后，再一起过滤，尽可能减少对于营养物质的损耗。

Q

细胞如何正确的消化？

待细胞长到密度80%左右可进行细胞消化（不要等到过密再消化，此时细胞状态可能会受影响），先用PBS润洗细胞2-3次，同时将配置好的胰酶（一般0.25%的浓度）置于37度培养箱中预热一段时间（这个对消化很有帮助），一般T25培养瓶中加入1 mL胰酶消化（如有需要也可以加到1.5 mL），然后将加了胰酶的培养瓶置于37度培养箱中消化，大部分细胞消化2-5分钟左右，大约90 —120 min左右，可取出，显微镜下观察细胞状态，细胞是否变得松动，呈现圆圆的分散状态，同时可轻拍培养瓶侧面（一定要轻柔），可让贴壁细胞更快的脱落。若细胞还未变成圆圆的状态，则继续放回培养箱消化，若细胞状态已经变成了松散的圆形了，则加入含血清的培养基终止消化，并且800 rpm，离心3 min收集细胞。不要等到细胞全部变圆后再终止，此时可能容易消化过度，在中间可借助轻拍侧壁加速消化。

Q

胎牛血清使用，替换现有品牌，该如何操作？

首先血清培养加入比例一般是10%（90%培养基（如DMEM）+10%胎牛血清），部分细胞可能是5%或者15%进行调整，部分原代细胞可能使用20%的添加比例，具体情况可以具体实验去摸索调整。

如果一直使用一种血清品牌，突然直接更换其他品牌，很容易出现细胞增殖变慢或者直接死亡的情况，哪怕是更换了性能更好品质更高的血清，也可能会出现这种情况，但并不代表这款血清品质不行，而是细胞适应了以前的环境和代谢，你突然打破了这种平衡，它短时间适应不了，所以必须要科学的驯化细胞去适应新的环境，因此建议梯度替换。

建议复苏细胞还是用原品牌血清，传代1-2代，代细胞培养状态稳定后，新血清按照25%占比（新血清：原血清=1：3）进行第一次换液，第二次换液50%占比，第三次换液75%占比，再到100%的占比逐步替换原血清，中间实时观察细胞状态，待细胞状态稳定后再进行新的比例替换。细胞密度：保证细胞处于对数增长期，按照1:2或者1:3的传代，维持较高的细胞密度。

Q

血清培养细胞时候，显微镜下看到的“小黑点”是什么？

镜下培养中出现“小黑点”的原因很多，可以大致按照这几点进行分析和排除：

1. 细菌污染：早期看到微小颗粒，后期可见移动的小黑点，并且培养液变得浑浊，变黄等，则怀疑是细菌污染；

2. 真菌污染：早期看到小黑点，后期可见菌丝结构，则小黑点可能是酵母或霉菌的孢子，怀疑是真菌污染；

3. 细胞碎片：可能出现细胞碎片，在镜下看起来像移动的“小黑点“，其实是细胞状态恶化产生的细小碎片。碎片产生原因较多，有可能是细胞消化过程中用力过猛产生了机械损伤，也有可能是细胞过密、营养不足引起的细胞凋亡，还有可能是支原体污染导致细胞状态不佳，产生的细胞碎片。

4. 血清沉淀：胎牛血清（FBS）中的纤维蛋白或磷酸钙等成分解冻后形成沉淀，显微镜下为均匀分布的黑色颗粒。

5. 培养器皿/试剂污染：培养器皿残留杂质；培养基、胰酶等试剂中含有颗粒物。

6. “黑胶虫”现象：一种非微生物污染的颗粒物，可能来源于血清、水或环境中的纳米级污染物，可随细胞移动。

Q

如果出现了“小黑点”，应该如何鉴别和解决？

1.显微镜观察：

高倍镜（400×）下观察黑点是否移动（细菌污染会轻微移动）。
细胞碎片通常形态不规则，而血清沉淀的话，颗粒均匀。
支原体需通过Hoechst染色或PCR检测确认，可使用支原体清除试剂进行处理或丢弃污染细胞。
排除了以上常见污染，显微镜下观察到细胞周围和培养液中有黑色胶状物质的小黑点，并且小黑点随着培养时间延长而逐渐增多，更换培养基以及洗涤细胞培养几代后仍然无效，情况无法改善，则可能是黑胶虫污染。可使用0.22 μm过滤培养基或血清，或提高血清浓度至20%短暂处理，或使用黑胶虫清除剂（Cat# 60725ES）。

2.培养液状态：

细菌污染后培养液短期（24-48小时）变浑浊；真菌污染后期可见菌丝絮状物。细菌真菌污染后应丢弃污染细胞，彻底消毒所有设备。
血清沉淀在静置后可能沉底，取上清，换液后，黑点会减少。

3.传代验证：

传代后若黑点减少，可能是细胞碎片；若黑点增殖，可能是微生物污染。

Q

血清是否需要灭活？如何灭活？

对于大多数细胞的培养而言，是不需要加热灭活的。但在免疫学研究、胚胎干细胞（ES细胞）培养、昆虫细胞和平滑肌细胞培养时推荐使用灭活血清。加热血清可以使补体去活化，但同时也会破坏热不稳定的蛋白。热灭活血清对细胞的生长只有微小的促进作用，甚至会因为灭活不当，破坏血清的品质，而抑制细胞的生长。如确实需要灭活血清，则将血清严格置于56℃环境中，加热30 min进行灭活，在血清的加热和灭活过程中需要不断地进行摇晃混匀。

Yeasen胎牛血清

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产品名称	产品货号	规格
Fetal Bovine Serum Gold 胎牛血清(特级)	40130ES50	50 mL
Fetal Bovine Serum Gold 胎牛血清(特级)	40130ES76	500 mL
Fetal Bovine Serum Gold Plus 胎牛血清（特级）	40131ES76	500 mL
Fetal Bovine Serum Gold Pro 胎牛血清（特级）	40132ES50	50 mL
Fetal Bovine Serum Gold Pro 胎牛血清（特级）	40132ES76	500 mL

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支原体去除	Mycoplasma Elimination Reagent MycAwayTM (1000×)支原体去除试剂（1000×）	40607ES01/03/08	100Μl/1mL/5×1mL
支原体预防	Mycoplasma Prevention Reagent MycAwayTM(2000×)支原体预防试剂（2000×）	40608ES03/08	1mL/5×1mL
细胞增殖/毒性检测	Cell Counting Kit (CCK-8) CCK-8试剂盒	40203ES	100T~10000T