支原体概念和污染的影响

支原体（Mycoplasma）又称霉形体，是目前发现的最小、最简单的无细胞壁的原核生物，直径大小0.1~0.3μm，能通过滤膜且呈高度多形性，是哺乳动物细胞培养中相对常见且难以检测的细菌污染物。

支原体污染对细胞培养造成多方面的不良影响，已经成为在细胞培养时的一个严重问题，保守估计常规细胞培养中支原体污染率为15~35%，严重干扰实验结果的可信度。

细胞培养中95%的支原体污染主要是由莱氏无胆甾原体、精氨酸支原体、口腔支原体、发酵支原体、人型支原体、猪鼻支原体引起的。支原体在培养基上，形成的菌落呈“煎鸡蛋“形状。细胞培养上清和细胞膜适宜支原体生长，寄生在细胞表面的支原体可以穿透宿主细胞膜。

支原体污染来源主要有：细胞培养液或其成分（如培养基原料、血清和其他试剂）、实验室操作人员、细胞培养箱、液氮培养箱、空气中的粒子和气溶胶、抗生素的过度使用、密封不当的细胞培养物和污染了支原体的细胞等。

与此同时，这些污染对应的危害为：导致细胞制品或以细胞为介质进行生产的产品在下游纯化过程中可能因未能有效去除支原体而造成批次报废、污染其接触的所有相关设备设施甚至中间或终产品、导致其他正常细胞受到支原体污染、导致重要细胞或病毒种子库受到支原体污染而报废、导致实验室整体环境受到污染而被迫停止生产或实验操作进行支原体去除、导致支原体产生耐受性而更难以去除、支原体污染面积扩大、对实验室中的其他细胞培养物造成威胁。

因此，定期进行支原体检测和去除，确保无支原体存在细胞培养体系内才能保障科学研究工作的正常进行。

支原体检测

支原体是一种比较常见但通常难以去除的污染类型，对于涉及细胞培养的生物制品工艺过程，法规要求“必须确保无支原体污染”。

2020年版中国药典三部《生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制》中提出对于生产用细胞，需要对主细胞库（MCB）、工作细胞库（WCB）、生产终末细胞（EOPC）进行支原体检查。
FDA, Guidance for Industry:Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications，提出对于原材料、病毒种子、未加工的收获液等都需要进行支原体控制。
ICH Q5D《用于生产生物技术/生物产品的细胞底物的起源和特征描述》也提到：对于原材料、病毒种子、未加工的收获液等都需要进行支原体控制。

图1.中外法规里要求的支原体污染检测点

传统的支原体检测方法主要为培养法和指示细胞法，但由于这两种方法的检测周期长或灵敏度问题，致使企业生产或产品放行周期拉长。而随着细胞基因治疗的发展，行业内对支原体检测时效性和灵敏度要求越来越高，短的货架期不足以支撑如此长的检测周期，因此快检的NAT方法从众多支原体检测方法中脱颖而出。

图2.中外法规里列举的支原体检测方法

基于NAT (nucleic acid amplification techniques)核酸扩增技术，翌圣生物开发了一系列支原体快速检测的试剂盒，其中包括荧光探针qPCR法支原体检测试剂盒、一步恒温显色法支原体检测试剂盒和巢式PCR法支原体检测试剂盒。

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荧光探针qPCR法支原体检测试剂盒

是一种快速定性检测生产原料、细胞库、病毒种子、病毒或细胞收获液、治疗用细胞中潜在支原体污染的产品，即主要用于生物医药领域的药物研发、生产、放行等方面。

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产品资质

符合法规：按照EP2.6.7、JP G3和USP 63药典要求验证，符合国际权威机构的标准；
配合审计：产品生产符合ISO13485质量体系标准，有完善的审计文件；
保障品质：试剂盒所需酶原料全自产，且已产业化，供货稳定；
技术经验积累：TaqMan法有技术沉淀，Kit灵敏度可达10CFU/mL及以下；
专注产品性能：Taq酶抗体库，双封闭抗体提高了Kit特异性、灵敏度、稳定性。

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产品特点

检测种类多：优化的TaqMan探针可检测多达183种支原体；
操作简便：样本制备和检测总时长<3h，无需培养法的28天等待；
灵敏度高：检测限达到可以替代直接培养法的10CFU/mL；
专属性强：针对16s rRNA设计引物探针，不与梭菌、乳杆菌等亲缘关系物种交叉反应；
安全性高：试剂盒内阳性对照(PC)无感染性，完全消除污染风险；
防干扰强：引入内部质控(IC)，可排除样本干扰、反应配制异常等因素，有效避免假阴性。

图3.荧光探针qPCR法支原体检测工作流程

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一步恒温显色法支原体检测试剂盒

采用独有的等温扩增技术，在颜色判别方面具有更强的辨识度，由蓝紫色（阴性）向天蓝色（阳性）变，更利于肉眼的判别，增加了防污染组分，杜绝假阳性现象的存在。

图4. 一步恒温显色法支原体检测操作流程

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巢式PCR法支原体检测试剂盒

不同于普通的一步法PCR检测方法，将原先的1对引物提高至3对引物，针对支原体16s和23s保守区进行巢式PCR扩增，在改变产品非特异性的同时大大提升了产品的灵敏度，可以检测低至单个拷贝的支原体。

图5.巢式PC法支原体检测操作流程

支原体去除

在细胞培养过程中，定期检测能够有效的避免支原体大量污染，但如果细胞已受支原体污染，则需对其进行及时处理，最佳处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。若受污染的细胞比较珍贵，必须去除支原体污染，可以通过混合使用抗生素以达到目的。由于支原体无细胞壁，因此传统的抗生素一般对其无效。此时，选择一款合适的支原体去除试剂尤为重要。

翌圣生物MycAway™ Treatment (1000×)支原体去除试剂，是一种混合抗生素制剂，含有三种对支原体具有抑菌作用的组分，分别是喹诺酮类、四环素衍生物类和大环内酯类抗生素。该支原体去除试剂可通过抑制DNA和支原体生长所必须的相关蛋白合成来取得良好的支原体清除效果，且对细胞无伤害，最大程度上挽救细胞，减少因支原体污染带来的损失。

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产品特点

毒性低：对细胞毒性小，不影响后续细胞实验，如细胞转染和活力检测等；
稳定性强：-20℃试剂能较长时间保存并保持高效用；
操作简单：只需将产品添加至支原体污染的培养基中孵育即可；
起效快：“立竿见影”、最快3天即可见效；
去除范围广：能去除实验室绝大多数支原体类型。

图6.支原体去除试剂细胞毒性检测图示

支原体预防

在细胞培养过程中，支原体污染常有发生，但由于其特殊性很难被肉眼和显微设备检测到，因此做好支原体的预防工作显得尤为重要。可通过向培养基中添加支原体预防试剂，来有效预防支原体的污染。

目前实验室支原体主要来自于：细胞间的交叉污染、工作环境或者实验器材的污染、实验者无菌操作不佳、污染的培养基或者试剂、带有支原体污染的原始组织或者器官等。翌圣生物开发的支原体预防系列产品，具有操作简单、方便、稳定性好等特点，非常适合日常细胞系培养中支原体预防。

产品信息

产品	货号	品名	规格
样本前处理试剂盒	18461ES	MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit 磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒（瓶装）	25T/100T
样本前处理试剂盒	18467ES	MolPure® Mag48 Sample Preparation Kit FN 磁珠法48孔样本前处理试剂盒FN（预封装）	3×16T/6×16T
核酸提取仪器	80511ES	48通道自动化核酸提取仪	48通量
支原体检测试剂盒	40619ES	MycAway® Mycoplasma Real-time qPCR Detection Kit (2G) 支原体qPCR检测试剂盒（探针法）(2G)	25T/100T
	40612ES	MycAway™ Plus-Color One-Step Mycoplasma Detection Kit 一步法快速支原体检测试剂盒	25T/100T
	40601ES	GMyc-PCR Mycoplasma Test Kit GMyc-PCR支原体检测试剂盒	10assays/20assays
支原体去除试剂	40607ES	MycAway Treatment (1000×) -Mycoplasma Elimination Reagent MycAway支原体去除试剂（1000×）	1mL/5×1mL
支原体预防试剂	40608ES	MycAway Prophylactic (2000×) -Mycoplasma Prevention Reagent MycAway支原体预防试剂（2000×）	1mL/5×1mL
	40605ES	MycAway Spray (Ready-to-use) 支原体喷雾剂（即用型）	500mL/2×500mL/10×500mL
	40609ES	MycGuard-1 Solution (100×)，for Disinfecting Water Bath of CO2 Incubator 细胞培养箱水盘1号消毒卫士（支原体污染预防）	100mL
	40610ES	MycGuard-2 Solution (500×)，for Disinfecting Ordinary Water Bath 水浴锅2号消毒卫士（支原体污染预防）	100mL