产品简介

 

支原体PCR检测试剂盒（巢式PCR）(2G)是基于巢式PCR法(NestedPCR)对各种生物材料（如细胞培养物、实验动物分泌物和动物血清等）支原体感染的检测。该试剂盒采用定量PCR技术，针对支原体16S-23S rRNA序列保守区域设计两套引物，进行两轮PCR扩增，以第二轮扩增产物为准进行支原体污染情况判断。其可检出包括口腔支原体(M.orale)、肺炎支原体(M.pneumoniae)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、精氨酸支原体(M.arginini)、鸡败血支原体(M.gallisepticum)、关节液支原体(M.synoviae)、发酵支原体(M.fermentans)、柠檬螺原体(Spiroplasma citri)、唾液支原体(M.salivarium)等在内的共34种支原体，灵敏度可达2.5 copies/uL，对于10 CFU/mL支原体标准菌株也可正常扩增有条带，具备特异性强、灵敏度高、操作方便快速等特点，可直接用于细胞培养上清液的检测。

本产品相较于常规PCR法支原体检测试剂盒，可避免由于引物与模板之间的非特异配对，导致非特异性产物的产生；还可灵敏的检测到样本中微量的支原体DNA，避免假阴性的产生。

 

产品信息

 

货号	40614ES10 / 40614ES20
规格	10 assays / 20 assays

 

组分信息

 

组分编号	组分名称	40614ES10	40614ES20
40614-A*	GMyc-1st PCR Mix	460 μL	460 μL×2管
40614-B*	GMyc-2nd PCR Mix	490 μL	490 μL×2管
40614-C**	Positive Control Template	20 μL	40 μL

^*PCR反应极其灵敏，为防止假阳性，加样时，最后加阳性对照。

^**40614-C：Positive Control Template，阳性对照。

 

运输和储存条件

 

干冰运输，-25~-15℃保存，有效期1年。

^*整个试剂盒若较长时间不用，请避光保存。其中40614-C长期不用时，可-85~-65℃冷冻保存。

 

使用说明

 

1. 实验前准备

1）提前准备实验所需试剂耗材：

如：琼脂糖凝胶、电泳缓冲液、DNA marker等试剂和移液枪、无菌吸头、离心管等耗材。

2）自备实验所需设备和仪器：

如：漩涡振荡器、PCR仪、微量离心机、电泳仪等。

2. 实验方法

1）待测样本类型：

a. 本试剂盒可以直接检测细胞上清、血清和培养基，以及细胞DNA等。细胞培养3-6天后，直接取其上清液进行PCR反应。为排除细胞培养基抑制PCR反应，阳性对照中需加入等量的细胞上清液。

b. 对于细胞悬液类样本，则需要先经过样本前处理，提取总DNA后，才可进行检测。

2）实验结果判读：

本试剂盒需要进行两轮PCR反应：第一轮PCR结束后，取其反应产物作为第二轮PCR的模板，根据两轮PCR产物电泳条带之有无及片段大小来分析结果（第一轮阳性对照PCR条带大小为389bp、第二轮阳性对照PCR条带大小为247bp）。其中，应以第二轮扩增产物结果为准，进行有无支原体污染的判断。

3）第一轮PCR：

a. 充分融解GMyc-1st PCR Mix（40614-A），按下列表格配制反应液：

试剂	阴性对照	实验组	阳性对照
GMyc-1st PCR Mix（40614-A）	46 µL	46 µL	46 µL
待测样本	/	4 µL	4 µL
Positive Control Template（40614-C）*	/	/	1 µL

表1 第一轮PCR反应体系

^*为防止40614-C污染，请先将阴性对照组和实验组加样完成后，再将40614-C加入阳性对照组。

b. 按下述条件进行PCR反应：

 

普通程序

94℃         5 min

94℃         30 sec

62℃         30 sec   30 cycles

72℃         30 sec

72℃         7 min

快速程序^*

95℃         5 min

95℃         15 sec

60℃         30 sec26 cycles

^*快速程序能够缩短反应时间，但对于灵敏度会略有影响，可自行选择使用普通程序或者快速程序。

4）第二轮PCR：

a. 充分融解GMyc-2nd PCR Mix（40614-B），按下列表格配制反应液：

试剂	阴性对照	实验组	阳性对照
GMyc-2nd PCR Mix（40614-B）	49 µL	49 µL	49 µL
1st PCR反应液（10倍稀释液）*	1 µL	1 µL	1 µL

表2 第二轮PCR反应体系

^*第一轮PCR反应液需经10倍稀释后，方可作为第二轮PCR的模板。

b. 按下述条件进行PCR反应：

普通程序（总时长90min）

94℃         5 min

94℃         30 sec

62℃         30 sec   30 cycles

72℃         30 sec

72℃         7 min

快速程序^*（总时长48min）

95℃         5 min

95℃         15 sec

60℃         30 sec26 cycles

^*快速程序灵敏度为5copies/µL，普通程序灵敏度为2.5 copies/µL,可以根据需要切换程序，常规情况推荐普通程序，且不同程序的循环数不请严格按照说明书进行。

c. 反应结束后，取7~10 μL的PCR反应液^*（无需加Loading Buffer），直接进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物^**。

^*以本轮（即第二轮）扩增产物为准进行支原体污染情况判断。

^**根据PCR产物电泳条带之有无及片段大小来分析结果（第二轮阳性对照PCR条带大小为247bp）。

5）本试剂盒的推荐使用频率：

检测场景	推荐的检测频率
新细胞进入实验室	必检
液氮保存前	必检
定期常规	每月检测一次
发现污染后	每周检测一次
发现细胞异常	随时检测

 

注意事项

 

1. 本产品仅作科研用途。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本试剂前请仔细阅读说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。

 

Ver.CN20241125