多重PCR概述

多重PCR(multiplex Polymerase Chain Reaction，mPCR)也称复合PCR，由Chambehian'于1988年首次提出。其基本原理与常规PCR相同，区别在于多重PCR反应体系加入一对以上引物，各对引物分别结合在模板相对应部位，最终扩增出一条以上目的DNA片段（图1）。

图1. 多重PCR原理

多重PCR可以通过优化反应体系和反应条件提高扩增的片段数量。理论上只要PCR扩增的条件合适，引物对的数量可以不限。另外，多重PCR在引物和反应条件的设计方面表现出很大的灵活性，既有单个PCR的特异性和敏感性，又较之快捷和经济，自提出以来已被广泛应用于包括核酸诊断在内的诸多领域（图2）。

图2 . 多重PCR的应用

多重PCR之难

需要指出的是多重PCR实验并不是简单地将多对特异性引物混合成一个反应体系。多重PCR之所以难，在于多个靶点之间扩增条件不兼容，每个靶点都需要旁边其他的引物配合。举个例子，就像“绑腿赛跑”（图3）。

图3. 绑腿赛跑

每个靶点的成功扩增都需要被捆绑在一起的两个人（一对引物）配合默契。而多重PCR就需要多对选手同时起跑又同时到达，并且所有参赛的每对选手都有最好的，而且均衡的发挥。

因此，多重PCR实际操作过程中的扩增效果和实际扩增的片段数目往往不尽如人意。而为了达到更好的扩增效果，一般我们可以通过以下几个方面进行优化：

2.1 引物

多重PCR实验中要求加入的多对引物既不能互相结合，也不能与模板DNA上目标片段以外的区域结合。另外传统的多重PCR实验中，为了使结果便于凝胶检测，还需设计不同扩增子片段大小不一。更麻烦的是，多重PCR中的不同扩增片段还会互相竞争资源，其结果是高丰度模板能够被很容易的检测到，而低丰度的模板彻底沦为背景。因而引物设计除了遵循一般的规则之外，还需要注意以下几点：

a. 引物特异性：

各引物与其它扩增片段不能存在较大的互补性，扩增片段之间也不能有较大同源性；

b. 引物长度：

一般18-24碱基，各引物之间不能互补，尤其避免3’端互补。较长的引物更易形成二聚体；

c. 退火温度：

退火温度选择标准：提高每一对引物的退火温度，然后在mPCR的时候采取最低退火温度；

d. 引物结构设计：

通过一些独特的结构设计，避免非特异性扩增或者引物二聚体。比如Ω引物（如图3），该引物包括三部分，5’端的序列，Ω环，3’端序列。其中两端的序列是和目标区域互补的，而环不是。对于Ω引物，当5端和3端序列完全配对才可以进行目标区段扩增，否则其结构不稳定（因为Ω环存在），导致扩增失败。

常用引物设计网址:

http://www.premierbiosoft.com/primerplex/index.html

http://people.ds.cam.ac.uk/ssb22/pooler/(only for cancer researchers)

2.2 反应体系

多重PCR的反应体系也是影响扩增效果的重要因素之一，体系中的各组分需满足每对引物对应的靶点的扩增量的要求。反应体系包括引物、模板、缓冲液、DNA聚合酶、dNTP和Mg2+等，其作用与优化方法如下表1所示。

反应体系	影响	优化
引物浓度	多重PCR体系中，就越多,片段越短引物用量和扩增的目的片段长度有着正比内在关系,即扩增片段越长,所需引物相对就越多。同时引物间易相互影响导致扩增效果不佳。	一般每种引物浓度E0 2μM左右，如果扩增效果不佳可增加弱引物得量减少强引物的量，不同基因引物相对浓度有较大差异（0.05-0.4μM）。理论上，引物与靶序列的摩尔比为103：1。
模板浓度	模板DNA浓度过高导致非特异性扩增，并且DNA有高级结构，浓度过高影响与引物的退火。	哺乳动物基因组DNA 100ng/ml；酵母基因组DNA 1g/ml；细菌基因组DNA0.1ng/ml；质粒DNA 1~5ng/ml。
dNTP和Mg2+浓度	dNTP能够结合镁离子，而DNA聚合酶发挥活性需要游离的镁离子。所以二者之间浓度需要平衡。	一般情况下200 μM 的dNTP要得到较好的扩增结果需要Mg2+浓度为1.5~2 mM。
PCR缓冲液	高盐浓度会使长片段的扩增产物难于变性解链。因而长片段产物在低盐浓度下扩增效果较好，而短片段产物在高盐浓度下扩增效果较好。	提高PCR缓冲液浓度，或者提高K+浓度至70-100mM。
DNA聚合酶	聚合酶量过低造成扩增产量的降低，过高导致基因扩增不平衡以及以背景的轻微增高。	DNA聚合酶的最适浓度为每25 μL反应体积中2U，实际根据扩增效果进行轻微调整。

表1. 反应体系的优化

注：本文中DNA聚合酶以Taq DNA聚合酶为例。具体实验中，还可以在反应体系中适当增加浓度为5%的DMSO或者5% 的甘油等辅助剂，有利于提高扩增效率以及特异性。

2.3 反应条件

多重PCR反应中会存在以下两种问题：1）目的产物长度不尽相同，而较小片段总是优先得到扩增；2）各对引物的最佳PCR条件也不尽相同，比如较长片段需要更长的延伸时间。因此为了保证最终扩增产物的量尽可能的一致，在优化反应条件的时候，尽可能选择有利于较大片段扩增的条件，见表2。

表2. 反应条件的优化

反应条件	影响	优化
复性温度	复性温度影响产物的特异性，提升复性温度会使产物更加特异，但过高会导致目的基因无法扩增。	先计算单个引物的熔解温度(Tm)，在此基础上推算复性温度T0(T0＝Tm-5)，实验时采用所有引物最低的复性温度。
延伸温度	延伸温度高会减少某些基因的扩增,即使延长退火时间和延伸时间也可能无法消除这种影响。	一般65-72℃，根据实验结果进行适当调整。
延伸时间	多重PCR中,由于同时扩增多个基因,酶和dNTP的缺乏就成为限制因素，就需要更多的时间来完成所有产物的合成。多重PCR中增加延伸时间,可以增加较长PCR产物的量。	根据目的片段的大小以及DNA聚合酶的扩增效率确定延伸时间。
循环数	循环数过低影响目标基因的产量，过高对于产量无明显影响	PCR产物量增加最明显的是在25个循环附近，通常28-30个循环即可

3. 常见问题解决办法

多重PCR扩增的时候主要的问题：二聚体、非特异性扩增以及扩增产物条带较弱。

表3. 常见问题解决办法

常见问题		建议
引物二聚体		a.重新设计引物，最根本的解决办法
		b.重新优化反应条件如提高退火温度
		c.重新优化反应体系如适当提高模板浓度，降低引物浓度
		d.提高退火温度
产物条带弱	所有条带	a.增加延伸时间
		b.降低延伸温度至62-68℃
		c.逐步降低退火温度
		d.适当提高DNA聚合酶浓度
	短片段产物	a.提升缓冲液浓度
		b.降低退火或者延伸温度
		c.增加弱条带的相对引物量
	长片段产物	a.增加延伸时间
		b.提高退火/延伸温度
		c.增加弱条带的相对引物量
		d.保持Mg2+浓度不变，降低缓冲液浓度
非特异性扩增		a.若非特异性片段为长片段，则增加反应缓冲液浓度；若是短片段，降低缓冲液浓度
		b.逐渐提高退火温度
		c.降低模板和DNA聚合酶用量
		d.保持dNTP浓度不变，增加Mg2+浓度

多重PCR要求在同一反应体系内对多个位点进行特异性扩增。因而引物间的配对与竞争性扩增均会影响扩增效果。如果能选择合适的反应体系以及反应条件则有望提高多重PCR的扩增效果。所以在进行多重PCR的时候，不应墨守陈规，要根据自身实验情况对实验条件进行不断优化，达到最佳扩增效果。