干细胞&小分子化合物 | ESCs兔胚胎干细胞培养全流程指南

2026-04-27

背景介绍

随着再生医学等领域崛起，兔胚胎干细胞因无限增殖和多向分化潜能成为研究核心，其体外培养研究近年突破技术瓶颈，为疾病建模、药物筛选等提供支撑。兔 ESCs 源自囊胚内细胞团（ICM），可在体外特定条件下维持未分化状态并保留多胚层分化能力，培养核心是模拟体内胚胎微环境，调控细胞因子和小分子化合物浓度。与小鼠、人 ESCs 相比，兔 ESCs 在生殖发育、异种器官移植等研究中优势独特。目前其培养体系已标准化，但对试剂纯度和培养条件精度要求较高，核心通过添加特异性生长因子（如 LIF、bFGF）和小分子化合物（如 CHIR-99021、Y-27632）实现稳定培养。

兔胚胎干细胞培养所需的化合物、生化试剂、细胞因子、耗材等：

产品名称	货号	应用场景
人LIF重组蛋白	92111ES	维持兔胚胎干细胞未分化状态
bFGF重组蛋白	91003ES	协同LIF发挥作用，促进兔胚胎干细胞增殖，提升细胞克隆形成率
CHIR-99021	53003ES	Wnt信号通路激动剂，抑制兔胚胎干细胞分化，维持其多能性
Y-27632	53003ES	Rho激酶抑制剂，减少兔胚胎干细胞复苏及传代过程中的凋亡，提升细胞活力
兔血清	36117ES	替代胎牛血清，降低异种蛋白干扰，更适配兔胚胎干细胞生长需求
DMEM/F12基础培养基	41406ES	近五年主流基础培养基，添加血清及生长因子后可满足兔胚胎干细胞基础生长需求
HEPES溶液	60117ES	维持培养基pH稳定，适配兔胚胎干细胞生长的酸碱环境要求
1× 重组胰蛋白酶消化液	40514ES	用于兔胚胎干细胞传代时的细胞消化，温和高效，减少细胞损伤
基质胶（Matrigel）	40191ES	模拟体内细胞外基质，促进兔胚胎干细胞贴壁生长，维持其形态完整性
青霉素-链霉素（双抗）	60162ES	青霉素：杀革兰氏阳性菌链霉素：杀革兰氏阴性菌
金属浴	80120ES	用于试剂溶解、消化液孵育，保障培养过程中温度稳定性
血清移液管（5mL）	84503ES	用于细胞悬液转移、试剂分装，符合无菌操作要求
吸头（10μL/200μL）	83021ES 83051ES	精准移液，避免交叉污染，适配干细胞培养的精细操作需求
锥形离心管（15mL/50mL，无菌）	83505ES 83507ES	用于细胞离心、重悬，保障细胞沉淀完整性，符合无菌培养标准
24孔培养板（无菌）	84013ES	用于兔胚胎干细胞复苏、传代培养，便于显微镜下观察细胞形态
针头过滤器（0.22μm，无菌）	84309ES	用于培养基及试剂过滤除菌，杜绝微生物污染，保障培养体系无菌性

培养方案

一、兔胚胎干细胞的复苏

1、将储存有兔胚胎干细胞的冻存管从液氮中取出，迅速置于37℃水浴锅中，轻轻晃动2-3分钟，确保冻存液完全融化（避免反复冻融，减少细胞损伤）。

2、将冻存管内的细胞悬液缓慢转移至15 mL无菌锥形离心管中，沿管壁缓慢加入5 mL预温至37℃的兔胚胎干细胞基础培养基，用血清移液管轻轻吹打2-3次，轻柔重悬细胞（避免剧烈吹打，防止细胞破裂）。

3、设置离心机转速为500 g，离心3分钟，使兔胚胎干细胞充分沉淀，随后缓慢弃去上清液（避免吸弃沉淀，减少细胞损失）。

4、用1 mL含10 μM Y-27632（Cat# 53006ES）或Y-27632 dihydrochloride（Cat# 52604ES）的兔胚胎干细胞完全培养基重悬细胞，轻轻吹打3-4次，确保细胞分散均匀，无明显细胞团块。

5、提前将基质胶铺于24孔培养板，置于37℃培养箱中孵育30分钟，待基质胶完全凝固后，将重悬后的细胞悬液加入孔中，每孔接种量控制在5×10⁴~1×10⁵个细胞。

6、将24孔培养板放入37℃、5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中，孵育24小时，待细胞贴壁后，更换新鲜的兔胚胎干细胞完全培养基。

7、复苏后2-3天，在显微镜下观察细胞形态，筛选出形态均一、折光性强、无分化迹象的细胞克隆，用于后续培养。

二、兔胚胎干细胞的维持培养

1、复苏后的兔胚胎干细胞贴壁生长，当细胞融合度达到70%-80%时，及时更换新鲜的完全培养基。

2、完全培养基配制：DMEM/F12（Cat# 41406ES）基础培养基+15%兔血清+10 ng/mL兔LIF+5ng/mL bFGF+2 μM CHIR-99021（Cat# 53003ES）+1%双抗（青霉素-链霉素）（Cat# 60162ES），用0.22 μm针头过滤器过滤除菌后，4℃保存，有效期不超过1周。

3、维持培养期间，每2天更换一次完全培养基，更换时沿管壁缓慢加入，避免冲击细胞贴壁层；同时在显微镜下观察细胞形态，若出现分化迹象（细胞形态变扁、克隆边缘模糊），及时更换培养基并调整生长因子浓度。

4、培养环境控制：严格维持37℃、5% CO₂、饱和湿度，CO₂浓度波动不超过±0.5%，温度波动不超过±0.3℃，避免环境变化导致细胞分化或凋亡；培养板需定期更换，一般每3-4天更换一次，减少细胞代谢废物积累。

5、维持培养1-2周后，细胞克隆数量显著增加，可进行传代培养（传代时机选择在细胞融合度70%-80%，此时细胞活力最佳，传代后增殖速度最快）。

三、兔胚胎干细胞的传代

1、传代前，将兔胚胎干细胞完全培养基、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（Cat# 40127ES）、PBS（Cat# 41403ES）缓冲液预温至37℃，做好无菌操作准备。

2、弃去24孔培养板中的旧培养基，用PBS（Cat# 41403ES）缓冲液轻轻冲洗细胞表面2次，弃去冲洗液，去除残留的血清和代谢废物（避免影响消化效果）。

3、每孔加入200 μL 1× 重组胰蛋白酶消化（Cat# 40127ES），轻轻晃动培养板，使消化液均匀覆盖细胞表面，置于37℃培养箱中孵育1-2分钟。

4、每孔加入500 μL兔血清，轻轻吹打3-4次，终止消化反应；随后将细胞悬液转移至15 mL无菌锥形离心管中。

5、500 g离心3分钟，弃去上清液，用2 mL兔胚胎干细胞完全培养基重悬细胞，轻轻吹打，使细胞分散为单个细胞或小克隆。

6、将重悬后的细胞悬液按1:3的比例接种至新的基质胶包被的24孔培养板中，每孔加入适量完全培养基，轻轻晃动培养板，使细胞均匀分布。

7、将培养板放入37℃、5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养，24小时后观察细胞贴壁情况，贴壁后更换新鲜完全培养基，继续维持培养。

8、传代过程中，可收集少量细胞进行多能性鉴定，确保传代后的细胞仍维持未分化状态，传代次数建议不超过10代，避免细胞增殖能力下降或分化潜能改变。

图1. 家兔胚胎干细胞及成纤维细胞的制备与蛋白提取流程[4]

参考文献

1. Qian Y, Zhao D, Sui T, Chen M, Liu Z, Liu H, Zhang T, Chen S, Lai L, Li Z. Efficient and precise generation of Tay-Sachs disease model in rabbit by prime editing system. Cell Discov. 2021 Jul 6;7(1):50. doi: 10.1038/s41421-021-00276-z. PMID: 34230459; PMCID: PMC8260710.

2. Honda A. Isolation and culture of rabbit embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 2013;1074:39-49. doi: 10.1007/978-1-62703-628-3_4. PMID: 23975804.

3. Borghesi J, Mario LC, Carreira AC, Miglino MA, Favaron PO. Phenotype and multipotency of rabbit (Oryctolagus cuniculus) amniotic stem cells. Stem Cell Res Ther. 2017 Feb 7;8(1):27. doi: 10.1186/s13287-016-0468-z. PMID: 28173846; PMCID: PMC5297200.

4. Intawicha P, Wang SH, Hsieh YC, Lo NW, Lee KH, Huang SY, Ju JC. Proteomic profiling of rabbit embryonic stem cells derived from parthenotes and fertilized embryos. PLoS One. 2013 Jul 4;8(7):e67772. doi: 10.1371/journal.pone.0067772. PMID: 23861804; PMCID: PMC3701598.

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