干细胞&小分子化合物 | hESC人胚胎干细胞体外培养全流程指南
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2026-04-27
背景介绍
再生医学与精准医疗快速发展，人胚胎干细胞（hESC）凭借无限自我更新和多向分化的全能性，成为基础研究与临床转化的核心载体。近五年，国内外在其培养体系优化、技术创新与临床转化上接连突破，打破传统培养局限，为重大疾病治疗和发育机制研究提供了重要支撑。
hESC 体外培养条件严苛，传统培养依赖血清和饲养层细胞，存在成分复杂、异源污染风险高、培养效率低、细胞状态不稳定等问题，严重限制其科研与临床应用。近几年，无血清、无饲养层、成分明确的培养技术成为主流，通过筛选关键小分子、优化生长因子组合，构建出高效稳定的培养体系，实现了 hESC 的稳定扩增与全能性维持。
相比传统技术，新培养体系有三大核心优势：一是实现 “无血清无饲养层”，降低临床风险、简化操作；二是精准调控成分，大幅提升干细胞增殖与分化潜能，可稳定传代 25 代以上；三是结合 3D 培养、微流控等技术，模拟体内发育微环境，助力发育机制研究。同时国产试剂迭代升级，打破进口垄断、降低成本，进一步推动了 hESC 研究的普及。
人胚胎干细胞培养所需的化合物、生化试剂、细胞因子、耗材等：
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产品名称 |
货号 |
应用场景 |
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DMEM/F-12 Reduced Serum Medium |
适配人胚胎干细胞 / 诱导多能干细胞培养，可显著降低血清用量，稳定支持细胞生长并维持未分化状态，兼容无血清培养体系 |
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B-27 无血清添加剂 |
去维生素 A 版无血清添加物（50×），高效支持人胚胎干细胞的自我更新与多能性维持，搭配基础培养基使用，满足干细胞稳定扩增需求 |
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人重组bFGF蛋白 |
维持hESC自我更新的关键生长因子，研究中优化浓度为10-20 ng/mL，提升细胞全能性 |
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Y-27632（ROCK抑制剂） |
抑制细胞凋亡，提升hESC复苏及传代存活率，是hESC培养的必备小分子试剂 |
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基质胶 |
替代传统饲养层，用于hESC贴壁培养，全程低温操作，现配现用，提升培养稳定性 |
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Accutase消化液 |
主流无酶消化液，温和消化hESC，减少细胞损伤，适用于高效传代 |
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人重组Wnt-3a蛋白 |
参与hESC全能性调控，优化培养体系中添加可提升细胞增殖效率 |
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HEPES溶液（1 M） |
维持培养基pH稳定，适配hESC严苛的培养环境，细胞培养级纯度 |
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血清移液管（5mL） |
无菌无酶，适配hESC培养的无菌操作要求，避免细胞污染 |
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24孔培养板（无菌） |
适用于hESC小规模培养及分化实验，常用培养载体 |
培养方案
一. 人胚胎干细胞的复苏
1、实验前准备：提前将无血清培养基置于室温避光平衡30min-1h，即用型基质胶铺板后，在37℃、5% CO₂培养箱中孵育1-2 h，取出后室温平衡20 min备用；恒温水浴锅设置37℃，超净工作台紫外照射30 min灭菌。
2、快速解冻：将储存有hESC的冻存管从液氮中快速取出，立即浸入37℃水浴中，快速摇动1-2 min，确保冻存液完全解冻，减少细胞暴露在室温中的时间，避免细胞损伤。
3、 离心重悬：将冻存管内的细胞悬液缓慢滴入提前加入2-3 mL无血清培养基的15 mL无菌离心管中，轻轻颠倒混匀，1000 rpm离心3 min，弃去上清液；加入1 mL无血清培养基，用移液管轻轻吹打3-5次，充分重悬细胞团块。
4、 接种培养：弃去铺板后的基质胶，将重悬后的细胞悬液加入24孔培养板中，补全每孔2 mL培养体系，水平十字轻轻晃动培养板，使细胞均匀分布；将培养板放入37℃、5% CO₂恒温培养箱中培养，次日观察细胞贴壁情况。
5、 后续维护：复苏后每24 h更换一次新鲜无血清培养基，避免培养基中活性成分耗尽，维持细胞正常生长状态。
二. 人胚胎干细胞的常规培养
1、 培养环境：全程维持37℃、5% CO₂、95%湿度的无菌培养环境，定期检测培养箱内温湿度及CO₂浓度，避免环境波动影响细胞生长。
2、换液频率：每24 h更换一次新鲜无血清培养基，换液时轻轻弃去旧培养基，避免触碰细胞层，加入新鲜培养基时缓慢滴加，减少对细胞的机械损伤。
3、细胞观察：每日在倒置显微镜下观察hESC形态，未分化的hESC呈典型的克隆状生长，细胞排列紧密、形态均一；若出现细胞分化、污染等情况，及时处理，确保细胞纯度。
4、培养周期：常规培养3-5天，细胞克隆达到一定密度后，即可进行传代操作，长期培养可稳定传代25代以上，仍保持全能性。
三. 人胚胎干细胞的传代
1、 传代准备：提前完成基质胶铺板及平衡，无血清培养基、Accutase消化液置于室温平衡，确保试剂温度与细胞培养温度一致。
2、消化处理：弃去培养板中的旧培养基，用PBS（Cat# 41403ES）缓冲液轻轻冲洗细胞层2次，每孔加入适量Accutase（Cat# 40506ES）消化液，37℃孵育3-5 min，在显微镜下观察到细胞克隆边缘松动、分散后，加入等量无血清培养基终止消化。
3、离心分离：用移液管轻轻吹打细胞，使细胞克隆分散成均匀的细胞悬液，转移至15 mL离心管中，1000 rpm离心3 min，弃去上清液。
4、重悬接种：加入适量无血清培养基重悬细胞，轻轻吹打3-5次，根据细胞密度按1:2-1:5的比例接种至铺有基质胶的培养板中（早代次细胞按1:2-1:3传代，建系后细胞按1:4-1:5传代），补全培养体系后均匀分布。
5、后续培养：将培养板放入培养箱中，次日观察细胞贴壁及生长情况，正常贴壁后按常规换液频率维护，确保细胞稳定生长。
图1 .a 传代周期示意图。b 第 5 天，2D 培养的人胚胎干细胞集落，标尺：200 μm。c 含有人胚胎干细胞球的悬浮培养袋。标尺：1 cm。d 悬浮培养传代 10 代后人胚胎干细胞球的核型分析[6]
参考文献
1. 喻松霞 郭玲玲 贺文凤 贺玲 李洁 李剑. 人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系的建立[J]. 基础医学与临床, 2013, 33(7): 892-897.
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3. Andersson-Rolf A, Groot K, Korving J, Begthel H, Hanegraaf MAJ, VanInsberghe M, Salmén F, van den Brink S, Lopez-Iglesias C, Peters PJ, Krueger D, Beumer J, Geurts MH, Alemany A, Gehart H, Carlotti F, de Koning EJP, Chuva de Sousa Lopes SM, van Oudenaarden A, van Es JH, Clevers H. Long-term in vitro expansion of a human fetal pancreas stem cell that generates all three pancreatic cell lineages. Cell. 2024 Dec 26;187(26):7394-7413.e22. doi: 10.1016/j.cell.2024.10.044. Epub 2024 Dec 2. PMID: 39626658.
4. Li Q, Yuan Y, Zhao W, Li Y, Shi J, Xiu Y, Han M, Han Y, Zhang J, Cheng S, Qi X, Sun X, Jia T, Xing J, Deng S, Yan X, Oura S, Li H, Sun Y, Yuan H, Ma X, Xin M, Zhao J, Zhu X, Wang C, Wang Q, Lin G, Yang X, Wei Y, Wu J, Wang H, Yu L. A 3D in vitro model for studying human implantation and implantation failure. Cell. 2026 Jan 8;189(1):70-86.e20. doi: 10.1016/j.cell.2025.10.026. Epub 2025 Dec 23. PMID: 41443192.
5. Li H, Zhao C, Xu J, Xu Y, Cheng C, Liu Y, Wang T, Du Y, Xie L, Zhao J, Han Y, Wang X, Bai Y, Deng H. Rapid generation of gene-targeted EPS-derived mouse models through tetraploid complementation. Protein Cell. 2019 Jan;10(1):20-30. doi: 10.1007/s13238-018-0556-1. Epub 2018 Jun 13. PMID: 29948855; PMCID: PMC6321812.
6. Li X, Ma R, Gu Q, Liang L, Wang L, Zhang Y, Wang X, Liu X, Li Z, Fang J, Wu J, Wang Y, Li W, Hu B, Wang L, Zhou Q, Hao J. A fully defined static suspension culture system for large-scale human embryonic stem cell production. Cell Death Dis. 2018 Aug 30;9(9):892. doi: 10.1038/s41419-018-0863-8. PMID: 30166524; PMCID: PMC6117302.
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