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产品简介
Tn5转座酶特异性识别转座子两端反向重复的ME序列(Mosaic End)，形成转座复合体后随机的将转座子插入靶DNA中。Protein G 偶联转座酶(Protein G-Tn5)，即通过将Protein G与改造的超高活性Tn5转座酶融合，形成兼具双重活性的新型融合酶(pG-Tn5 Transposase)，可在抗体引导下精准靶向切割目的蛋白附近的DNA序列，适用于CUT&Tag (Cleavage Under Targets and Tagmentation)技术。CUT&Tag是替换传统的ChIP-Seq用以研究蛋白质-基因组互作的新技术，与后者相比，它具有显著优势，如：信噪比高，可重复性好，实验周期短（1天实现从细胞到文库构建），细胞投入量低等，该方法适用于表观遗传学、肿瘤、干细胞等研究领域。
组分信息
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组分编号 |
组分名称 |
14530ES60 |
14530ES76 |
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14530-A |
pG-Tn5 Transposase (10 U/μL) |
10 μL |
50 μL |
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14530-B |
Assemble Buffer |
100 μL |
500 μL |
|
14530-C |
5×Tagment buffer |
500 μL |
3×1 mL |
|
14530-D |
6×Terminate Solution |
500 μL |
3×1 mL |
|
14530-E |
Annealing Buffer |
500 μL |
3×1 mL |
储存条件
pG-Tn5 Transposase于-85~-65℃保存，其余组分可于-25~-15℃保存，有效期1年。
注意事项
1. 转座酶对温度敏感，建议尽快完成接头包埋，生成的转座子可于-25~-15℃保存，有效期1年。
2. 本产品仅作科研用途。
3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
使用说明
以高通量测序建库为例，在使用前，请务必仔细阅读使用说明。
- 接头制备
1）Illumina平台参考引物名称及序列：
Primer A：5'-phos-CTGTCTCTTATACACATCT-NH2-3'
Primer B：5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3′
Primer C：5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3′
2）使用Annealing Buffer溶解Primer A、Primer B、Primer C至100 μM。
3） 分别配制如下反应体系：
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组分 |
反应1 |
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Primer A（100 μM） |
10 μL |
|
Primer B（100 μM） |
10 μL |
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total |
20 μL |
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组分 |
反应2 |
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Primer A（100 μM） |
10 μL |
|
Primer C（100 μM） |
10 μL |
|
total |
20 μL |
4）分别将反应1和反应2涡旋振荡充分混匀，并短暂离心使溶液回到管底。置于PCR仪内，进行如下反应程序：热盖105℃ On，94℃加热2 min。时间到后，停止反应程序，不要打开热盖，让PCR管在PCR仪器中自然冷却2 h，然后再于4℃中放置5 min。
5）反应结束后，将反应1和反应2等体积混合，混匀。命名为Adapter Mix，-25~-15℃保存。
2．转座子生成
1） 配置以下反应体系：
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组分 |
体积（μL） |
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pG-Tn5 Transposase (10 U/μL) |
2 |
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Adapter mix (25 μM)* |
1.6 |
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Assemble Buffer |
Up to 20 |
2）反应条件：使用移液器轻轻吹打充分混匀。置于25℃反应1 h（热盖关闭）。反应产物命名为pG-Tn5 Mix，可直接应用于建库实验，或-25~-15℃保存。
3. DNA片段化测试
1）配置以下反应体系：
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组分 |
体积（μL） |
|
Input DNA (50 ng/μL) |
X* |
|
5×Tagment buffer |
4 |
|
pG-Tn5 Mix |
1** |
|
ddH2O |
Up to 20 |
*DNA 使用量越大，片段化产物平均长度越长；反之，片段化产物平均长度越短。
**如需提高打断程度，可提高pA-Tn5 Mix使用量；反之，可减少酶使用量。
2）片段化反应程序
轻轻吹打或振荡混匀，短暂离心。按照下表所示反应程序，进行片段化反应。
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温度 |
时间 |
|
热盖105℃ |
On |
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55°C |
10 min |
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4°C |
Hold |
3）DNA片段化终止
配置以下反应体系，在上述片段化产物中添加下表中各反应组分，使用移液器轻轻吹打20次混匀。
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组分 |
体积（μL） |
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片段化产物 |
20 |
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6×Terminate Solution |
4 |
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Total |
24 |
按照下表所示反应程序，进行终止反应。
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温度 |
时间 |
|
热盖105℃ |
On |
|
55°C |
10 min |
|
4°C |
Hold |
待样品温度降到4°C后，取出PCR管，进行片段化产物纯化，可以选择1.2×磁珠纯化，推荐使用Hieff NGS® DNA Selection Beads（Cat#12601ES），最终使用21 μL ddH2O洗脱片段化产物。请勿使用TE等含金属离子络合剂的缓冲液洗脱片段化产物！
4）片段化产物质量控制
a. 使用 Qubit 进行浓度测定。
b. 使用 Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer 进行长度分布检测。
5）片段化产物扩增
可根据具体的实验目的与测序平台选择合适的试剂进行扩增实验。
Ver.CN20241230
